[New Western blot 6/6] 단백질 밴드 촬영하고 데이터 분석하기

[@낮잠자는징징이]

감사합니다 ㅎㅎ 도움이 됐어요

[@ThisIsGraduateStudent]

@@낮잠자는징징이 감사합니다. 도움이 되셨다니 너무 다행입니다. ㅎㅎ 좋은 하루 되세요 😊

[@urizipcrab]

감사합니다 ㅎㅎ 새해복 많이받으세요

[@ThisIsGraduateStudent]

지렁이님도 새해복 많이 받으세요 🥰

[@yeonjookim5124]

넘넘 유용해요🎉🎉감사합니당 대학원생 홧팅

[@ThisIsGraduateStudent]

도움이 되었다니 다행이에요 ☺️ 감사합니다 ㅎㅎ 좋은 하루 되세요

[@d.v.m]

기다리던 마지막편! 감사합니다^^

[@ThisIsGraduateStudent]

오래 기다리셨죠? ㅠㅠ 죄송합니다 ㅠㅠㅠ
좋은 밤 보내세요 감사합니다 🥰

[@kyukyuthin-g3c]

석사과정때 한번도 해번적 없었던 실험이기도 하고 직장에서 무조건 해야 되는 일이 생겼가지고 찾았는데 너무 도움이 많이 되었습니다. 잘 공부했습니다. 감사합니다.

[@ThisIsGraduateStudent]

@@kyukyuthin-g3c 도움이 되셨다니 다행입니다 ㅎㅎ 혹시 궁금한게 생기시면 언제든 오세요. 성심껏 도와드리겠습니다 🙇☺️

[@kyukyuthin-g3c]

@@ThisIsGraduateStudent 감사합니다, 선생님🙏

[@이스-u7k]

유익한 영상 너무 잘 봣어용!!! 혹시 monoclonal AB를 사용하는데도 잡밴드가 많이 뜨는 경우에는 washing을 많이
하면 될까요??

[@ThisIsGraduateStudent]

감사합니다 이스님!! 😊 제가 사용하는 monoclonal Ab 중에도 특히 background noise가 심하게 보이는 항체들이 있는데, 2차 항체 붙인 후 워싱을 오래 해주는 편입니다. Washing을 오래 하면 말씀하신 것처럼 잡밴드가 많이 사라지더라구요.
제가 워싱하는 방식은 이렇습니다.
Blocking (30 min) --> Primary Ab (120 min) --> 1st washing (10 min, 10 min, 10 min) --> Secondary Ab (60 min) --> 2nd washing (10 min, 10 min, 60 min, 10 min)
3번 정도 보통처럼 워싱해주시고 용액을 갈아준 후 1시간 정도 워싱을 더 해줍니다. 그러면 깔끔하더라구요 😊 물론 미리 차갑게 만들어둔 워싱용액이면 더 잘된답니다. 🥰
오늘도 좋은 하루 보내세요 🙇

[@이스-u7k]

@@ThisIsGraduateStudent 감사합니다! 지금 1차 워싱하는데 십분씩 해볼게용!!

[@ThisIsGraduateStudent]

@@이스-u7k 화이팅입니다!! ㅎㅎ

[@이스-u7k]

혹시 디텍을 할 때 단백질이 디덱이
안되는 경우에는 어떻게 하면 좋을까요?? 레더 프로테인까지 같이 안뜨고 있어서요. 동일 항체를 다른 셀라인에 붙여 디텍을 하면 뜨는데.. 왜 이런지 잘 모르겠어요ㅠㅠ

[@ThisIsGraduateStudent]

@@이스-u7k 래더 프로틴은 육안으로 볼 수 있는 단백질인데, 멤브레인 위에도 안 보이시나요? 그러면 트랜스퍼가 안 됐다는 뜻인데... 하지만 이스님이 트랜스퍼를 반대방향(멤브레인-->젤)으로 하셨을리는 없을 것 같고...
다른 샘플에 하셨을때 항체가 잘 작동한다고 하셨죠? 그 샘플을 positive control로 같은 젤에 넣어 내리고 디텍션했을 때도 검출 안되나요? 처음 해보는 샘플은 지난번 잘 검출된 샘플을 함께 걸어 디텍션 해보시는게 좋아요. 지난번에 잘 나온 샘플이 이번에 디텍션이 안된다면 그건 과정의 문제일 확률이 높으니까요.
아니면 혹시 샘플의 종(마우스, 사람, 랫트 등)이 항체의 reactivity와 일치하나요? 항체의 data sheet에 보시면 나와 있을겁니다. Cross reactivity도 있는지 살펴보세요!!
그래도 문제점이 안 보이시면 댓글을 한번만 더 부탁드립니다...!

[@바다수영-k2u]

선생님...혹시 mouse pancreas 파라핀 섹션 해보셨나요? ㅜㅜ

[@ThisIsGraduateStudent]

네, 해보았습니다. 저는 장염 연구자라 췌장을 main으로 다루진 않지만, 학부생 실습 표본 제작 때문에 자주 해보았습니다. 혹시 도움이 필요하시다면, [e-mail]으로 연락주세요. 성심껏 도와드리겠습니다. 🥰

[@바다수영-k2u]

@@ThisIsGraduateStudent 메일드렸어요!! 감사합니다!!

[@ThisIsGraduateStudent]

@@바다수영-k2u 네, 감사합니다. 답장 드렸습니다!

[@yj8919]

안녕하세요, 웨스턴블롯을 한번도 안 해본 대학원생입니다.. 단백질 샘플을 미리 대량으로 저장해둔 뒤 추후 분석실험을 해야하는 상황에서 “샘플저장에” 고민이 있어 대학원생인 것님께 여쭤봅니다. 꼭 답변 부탁드려요ㅠㅠ!
1. 제가 세포에 리파를 넣어 단백질 추출 후 상층액만 보관할 때, 이를테면 “리파 100람다의 상층액이 저장돼있고 이걸 정량했을 때 단백질 농도가 너무 높으면 희석해서 쓸 수 있나요..?”혹여나 제가 200람다를 넣었다가 단백질 농도가 낮아 웰에 로딩할 수도 없고 샘플을 다 버리기 될까봐 (농축 방법이 있는지) 여쭤봅니다ㅠㅠ
2. 상층액 100람다가 저장된 상태에서 웰에 20mircrogram 의 단백질을 로딩한다면(그리고 이 양이 20람다라고 한다면.) 저장된 한 샘플로 4번 실험할 수 있는 개념인가요..? (20람다씩 *4번하면 거의 100람다니까)이 샘플로 한번 실패해도 4번은 할 수 있는 기회가 있는건지, 아니면 duplicate한다던가 한번애 더 써야하는게 필요한지 궁금해요..정말 어이없는 질문일 수 있지만 시간나실 때 알려주시면 큰 도움 될 거 같습니다..!

[@ThisIsGraduateStudent]

안녕하세요! 단백질 샘플 저장 및 사용에 고민이 있으시군요. 전혀 어이없는 질문이 아니라, 실제로 많은 대학원생분들께서 고민하시는 문제입니다. 답변 드리겠습니다.
1. 물론 희석 가능합니다. 세포의 양, 단백질의 양에 따라 lysis buffer (RIPA)를 100~500 uL (35 mm dish 1개 기준)까지 다양하게 골라 사용합니다. 제가 주로 보는 단백질은 양이 많아서 400 uL에 lysis하여 저장하기도 합니다. 만약 100 uL에 lysis하셨다가 농도가 너무 높으면 RIPA로 희석하셔도 됩니다. 다만 희석이나 농축이라는 것은 2배, 3배 한다고 체감이 될만큼 농도가 확 변하진 않습니다. 생물학에서는 적어도 5배~10배 정도는 변화를 줘야 그게 실험 결과로 나타납니다. 100 uL에 녹아있는 단백질이 200 uL를 더 넣는다고 안 보이진 않습니다. 걱정마세요 😊
2. 네, 맞습니다. 20 uL*4~5한 양으로 생각하시면 됩니다. 다만, 첫 Western blot이 실패했을때 같은 조건으로 다시 한번 해보는건 권장드리지 않습니다. 같은 실험 방식으로 다른 결과가 나오길 기대하는 것은 과학적이지 못한 생각입니다. 항체 농도를 다르게 해보든, 처리 온도를 다르게 해보든, 1개씩 조건을 변화해보면서 나머지 80 uL (남은 기회 4번) 단백질을 실험해볼 생각을 해야합니다.
그리고 제가 영상에서는 20 uL를 로딩하였으나, 너무 높은 농도의 단백질이라면 10 uL만 로딩해도 됩니다. 너무 적은 농도의 단백질은 농축하거나 30 uL까지 걸기도 하죠. 결과가 잘 안나온다면, 그 이유를 생각해보고 이유를 해결할 수 있게 다음 실험을 디자인해야 합니다. 유연하게 생각해서 대처해보세요 🥰
혹시 더 궁금하신 점이 있으신가요? 🤔

[@yj8919]

@@ThisIsGraduateStudent 답변 정말 감사합니다. 많은 도움되었고, 주신 조언 참고해서 추후에 실험 디자인 해보도록 하겠습니다:) 추가로 질문 2개가 있습니다.
1. sigma 기준(5x10^5 cells~5x10^6 cells/100µl RIPA)을 참고하여 적정량의 lysis buffer를 cell에 넣어주려고 합니다. 단백질이 고농도일 때 희석할 수 있다는 건 알게 됐는데, 그럼 만약 "단백질 농도가 낮을 경우 농축할 수 있는 방법"은 어떤 건지 알 수 있을까요?
2. 개인적인 질문일 수 있지만, cell에서 추출한 RIPA 상층액 100µl를 1) 단백질 정량용(BCA assay)으로 10µl 2) 나머지를 40µl,50µl로 나눠서 2 tube로 저장하려고 합니다. 웰에 로딩할 샘플 양을 아끼고자 “정량용 샘플은 10µl만” 저장하려고 하는데, 이렇게 소량(10µl 혹은 이보다 더 적은 양)으로 단백질 정량(ex. BCA assay)을 해도 괜찮은지 궁금합니다. 추출한 단백질 상층액을 tube에 지혜롭게 저장하는 방안이 있을까요..?
정말 감사드립니다..!

[@ThisIsGraduateStudent]

@@yj8919 질문이 상당히 고급지셔서 깜짝 놀랐습니다. 실험을 많이 해보신거 같은데요...? 부족하지만 답변 드리겠습니다.
1. 농축(concentration)의 방법은 상당히 다양하지만, 일반적으로 많이 쓰는 방법은 filter를 이용한 centrifugation입니다. 필터를 사용해서 단백질은 거르되 물만 빼내는 거죠. 방법은 필터를 conical tube나 ep tube에 끼우고, 그 안에 protein lysate를 넣어 원심분리하게 됩니다. Filter는 보통 3K, 5K, 10K, 50K 등으로 구분하는데, K는 걸러낼 수 있는 단백질의 최소 kDa를 의미합니다. K가 클수록 필터의 구멍(pore)가 커지게 되죠.
만약 10K filter로 농축을 진행한다면, 10 kDa 이상의 단백질은 걸러지지만(concentrate, 농축액) 10 kDa 이하의 단백질은 물과 함께 섞여 아래로 빠져나오게 됩니다(filtrate). 여과된 filtrate는 버리고 필터에 남은 concentrate만 쓰므로, 10 kDa 이하의 단백질은 샘플에 더이상 남아있지 않죠.
선생님께서 주로 보시는 단백질이 몇 kDa인지 확인하시고, 그거 보다 작은 K를 가진 filter를 쓰시면 됩니다. 10K filter가 무난하고, 저는 amicon 회사의 ultra-0.5 centrifugal filter unit 10K 제품을 주로 씁니다. 500 uL의 protein lysate를 넣고 14,000 g로 10분 돌려주면 12X의 농축된 27 uL를 얻을 수 있습니다.

[@ThisIsGraduateStudent]

@@yj8919 + 답글이 길어 여기에 추가로 작성하겠습니다.
하지만, 필터 방식이 가장 간편하고 시간이 적게 걸리는 장점이 있으나, 단백질이 필터에 끼여 일부 소실된다는 단점이 있습니다.
2. 단백질 정량 하실때 소량의 단백질을 사용하셔도 괜찮습니다. 특히 희귀하거나 값이 비싼 단백질은 2 uL만 넣고 정량하기도 합니다. 하지만, 적은 양으로 넣어 정량할수록 오차가 커질수있단 점은 잘 감안해야겠죠. 2 uL중 0.1 uL만 더 들어가도 5%나 높게 측정될테니까요.
또한, 단백질을 aliquot하는 방법을 물어보신 것이라면, 저는 제가 실험에 주로 사용하는 양의 3~4배의 양으로 aliquot합니다. 이게 무슨 말이냐면, 단백질을 Western blot할 때 보통 30 uL를 사용하는데, 30 uL의 3~4배인 100 uL로 aliquot한다는 뜻입니다. 제가 주로 400 uL의 RIPA buffer로 lysis하므로, 4개의 tube에 aliquot하는거죠. 3~4배라고 정한 이유는 제가 생각하기에 freeze and thaw (냉동과 해동의 반복)로 인해 단백질이 파괴되는 것은 3번이 한계라고 생각해서 그렇습니다. 단백질을 냉동, 해동을 해도 좋되 그걸 3번 초과로 반복하면 다 변성되어 더이상 못쓸만한 샘플로 생각하는 겁니다. 😊
이 기준은 사람마다 다를 수 있으나, 단백질을 자꾸 얼렸다 녹였다 하는걸 피하는건 중요한 관점입니다. 그래서 저는 3번 해동할 양으로만 tube에 aliquot합니다.
답변이 도움되셨나요? 🥰

[@yj8919]

@@ThisIsGraduateStudent 잘 이해되었습니다..!도움주셔서 정말 감사드립니다..🧡