ImageJ | Cuantificación automática de fluorescencia nuclear
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- Опубликовано: 20 ноя 2017
- Usando máscaras binarias creadas a partir de tinción nuclear, por ejemplo, DAPI.
Update 2022: Nueva serie de videos tutoriales para cuantificación de inmunofluorescencias con Macros usando Inteligencia Artificial y Análisis posterior en R:
• Análisis Automático y ...
Concreto y muy claro. Gracias Ariel, saludos desde Alemania.
Exelente vídeo, me fue muy útil en el analisis de imagenes de la clase de Anatomia da madeira. Saludos desde Honduras.
Excelente! me salvaste la vida, gracias!
Excelente video, te luciste. Saludos desde Chile.
It is very nicely done, Ariel. Even I didn't understand the language but I could follow you every single step. Can you tell me please how to quantify fluorescence intensity in cytosol?
Hey, thanks for your video. It was wonderful to learn so much about ImageJ. I just had a query, how to measure the velocity of a rising bubble in any solution using Image J?
Excelente!!
Gracias! Hoy en día existen otras alternativas que usan inteligencia artificial y que funcionan impresionantenente bien y son muy fáciles. Te recomiendo buscar el plugin Stardist para imageJ. Segmenta núcleos muy muy bien. Suerte!
Hola Ariel, estoy intentando ver la potencialidad del programa para analizar imagenes de microscopio de piedras. Antes de sumergirme más, quiero ver si realmente me va a servir. Leí un artículo que dice que lo usó y por eso me puse a explorar de qué se trata. Te parece que es posible? Saludos
Hola, buenas tardes. Fue un vídeo muy informativo, gracias. Crees que puedas explicar un poco cual sería la forma ideal de analizar todos estos resultados... ya sea en Excel o en R
Hola Marcela! Gracias a vos. Te recomiendo tratar de poner un pie en R, es una buena inversion a futuro y te da muchas mas funcionalidades que excel. Para aprender, te recomiendo una pagina de tutoriales de R y Python para analisis de datos, que se llama Datacamp. Podes hacer algunos cursos gratis, pero es pago... no es TAN caro, considerando que si te pones un par de meses con dedicacion podes aprender un montonazo. Te recomendaria empezar por un curso que se llama "Introduction to the tidyverse". Saludos y suerte!
Hola crack!
Recién viendo este video, está muy bueno.
Una duda. Al momento crear la mascara binaria y tener las celulas en "rojo", una vez que hago click en apply las celulas quedan en blanco y el fondo en negro, y no como te aparece a ti que las celulas quedan en negro y el fondo blanco. Como lo soluciono?
Me encantó
Muchas gracias!! Hoy en día, lo más eficiente para segmentar nucleos es usar Stardist, un plugin de ImageJ que automaticamente encuentra todos los nucleos y carga las ROIs, y usa inteligencia artificial. imagej.net/plugins/stardist
Suerte!!!!
Hola quisiera saber donde puedo conseguir esas imágenes del principio
Hola... Para hacer histogramas para la comparación de las imágenes de células que han recibido diferentes tratamientos si uso el "Mean gray value " directamente o calculo el CTCF "corrected total cell fluorescence" Gracias.
Hola, como estas? Depende de lo que quieras medir, pero en la mayoria de los casos uno mide valores medios, dado que le interesa una medida de la "concentracion". Pero de nuevo, depende la pregunta. Por ejemplo, si te interesara cuantificar el DAPI para tener una medida del contenido N o 2N del nucleo (similar al ioduro de propidio en citometria), en ese caso te interesa la fluroescencia total. Con respecto a la formula que mencionas, antes que nada siempre antes de cuantificar hay que restar el background de la imagen (por ejemplo, en FIJI midiendo la fluorescencia en varios lugares donde no hay celulas, promediando ese valor y luego restandolo a toda la imagen). Eso hay que hacerlo estemos midiendo el valor medio o la fluorescencia total (integrated density en imageJ). La cuenta que vos mencionas, es la que te da el valor total de fluorescencia pero en imagenes a las que no se les restaron el background. Fijate que, justamente, lo que hace esa formula es restar el background a tu medicion especifica. En ese sentido, es mas sencillo restar el background a la imagen entera y, si lo que queres es medir fluorescencia total, directamente usar el valor "integrated density". Espero haber sido claro! Saludos y suerte!
Hola Ariel, gracias por el tutorial. Estoy intentando analizar diferencias de intensidad entre nucleo y citoplasma y he hecho algo muy parecido a como has hecho aqui, con dos mascaras: total y otra nuclear (DAPI), calculando luego las intensidades en cada una de ellas, pero algo no esta funcionando bien porque mis controles no muestran lo que deberian (un mutante en exportacion no muestra practicamente ninguna diferencia entre intensidades). Si tienes un rato y ganas de poner algo parecido estaria genial! y si te pasas por Philadelphia te invito a un cafe cuando vengas
Hola Pau. Nunca hice ese tipo de mediciones, pero la forma de proceder seria similar. En ese caso, tenes alguna forma de automatizar la generacion de la mascara de la celula total, o lo haces a mano? Tene en cuenta que si llegaste a tener la mascara nuclear y la mascara total, podes facilmente restarle la mascara nuclear a la total y obtener una nueva mascara puramente citoplasmatica. Y despues es cuestion de medir en cada compartimento, de alguna manera conservando el orden de las celulas con cada mascara. Lamento no haber sido de mayor ayuda. Gracias por la invitacion, ojala alguna vez vaya :D
@@MsWaiso Hola Ariel, gracias por tu respuesta! Eso es lo que hice pero hay algo que no esta bien, tengo un mutante que tiene un defecto en exportacion de mRNAs (acumula señal en el nucleo) y cuando hago los ratios N/C no tiene mucho sentido. Estoy pensando que cuando resto la mascara total a la nuclear se queda la señal en los nucleos pero creo que los pixeles negros que quedan en la resta estan haciendo bias en el resultado. Anyway, me sigo peleando a ver si lo saco. Gracias por todo! y avisa si subes por aqui. Saludos!
Hola Ariel, estoy utilizando este video como guia, sin embargo, debo estandarizar un método en células tumorales y las lineas en que trabajo crecen muy juntas y es dificil diferenciar una célula de otra con la mascara que utilizas, ¿Conoces de un plugin que me pueda ayudar en Fiji?
Buenas! Sin duda, hoy en día para segmentar nucleos, yo iría por Stardist, un plugin de Fiji/ImageJ entrenado con redes neuronales y que funciona de maravilla! imagej.net/StarDist
Espero que te sirva, saludos!
Hola Ariel, gracias por el vídeo. El programa permite analizar imágenes en formato JPEG?
Si! Pero te recomiendo siempre trabajar con tif u otros formatos que no compriman la imagen como lo hace el jpg, ya que perdes información. Saludos!
Hola! La creación de máscaras binarias puede servir solamente para cuantificar verdad? Sólo iría hasta el punto de Analyze particles.
Y otra consulta, tengo que medir intensidad de fluorescencia en el citoplasma (tengo un marcador fluorescente verde en el citoplasma y DAPI para los núcleos). Se puede crear una máscara para el citoplasma? O cómo debería proceder?
Gracias, soy nueva en el programa
Hola, te pido disculpas, se me paso este comentario! Hay formas de hacer mascaras o labels sobre el citoplasma, pero son un poco mas dificil que con los nucleos, que son en general esfericos. El problema es que muchas veces las celulas se unen un poco y entonces no se pueden separar las mascaras de las distintas celulas. Una opcion es usar CellProfiler para detectar objetos primarios (nucleos en DAPI) y a partir de estos, objetos secundarios en el canal con fluorescencia citoplasmatica. Eso ayuda a delimitar las celulas (dado q cada celula tiene un nucleo). Otra opcion es que chequees el nuevo software CellPose que funciona barbaro, pero hay que correrlo en Python. Pero tiene una interfaz grafica, por lo que yo iria por ahi. Saludos y suerte!
ayuda por favor, quiero medir fluorescencia de membrana citoplasmatica, como puedo hacerlo, la verdad es que no he usado el programa nunca, y solo he encontrado este video relacionado con lo que me interesa, si pudieras ayudarme, gracias
Hola, disculpa la demora, se me paso! Es algo complejo, te recomiendo investigar los manuales de ImageJ o buscar otros tutoriales. Un abrazo!
Hello Ariel, It will be very helpful if you can provide subtitle also.