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Buenas! Debe ser algun temita con las cuentas. Si vas a transformar a log2 (cosa q recomiendo si el fold change de tus tratamientos es grande), tenes q transformar los datos de CT a log2, despues tomar la media comun (no geometrica, en excel "Promedio" o "Average") de las 3 replicas de tu dia 0. Entonces, te armas una nueva tablita y le restas a todos los CTs de todos los tiempos y replicas ese valor promedio. Si haces el promedio normal (el mismo q antes, el aritmetico), te tiene que dar 0. Ojo, Excel a veces no le gusta los valores "0" y en vez de mostrarte eso te muestra un numero muy muy chiquito, tipo 10 a la menos 16. Pero eso es, a fines practicos, cero. Espero haberte ayudado, saludos!

@@MsWaiso Perfecto, muchas gracias. Me estaba pasando lo del excel y el cero, me pone valores tipo 1.1 a la -15 o -16..

@@sofiacarvajal22 Genial, en su momento me paso lo mismo y no entendía qué pasaba. Exitos!

Muchas gracias!! Hoy en día, lo más eficiente para segmentar nucleos es usar Stardist, un plugin de ImageJ que automaticamente encuentra todos los nucleos y carga las ROIs, y usa inteligencia artificial. imagej.net/plugins/stardist Suerte!!!!

Muchas gracias :)

Hola Florencia. Cuando queremos generar una medida intermedia entre dos housekeepings distintos, usamos la media geometrica porque sus niveles relativos de expresion pueden ser muy diferentes, como es el ejemplo que muestro. Si no lo hicieramos, el housekeeping de mayor expresion relativa "pesaria" mas que el otro en el calculo de este valor intermedio. Cuando unimos los valores de las replicas biologicas, solo en el caso en que estemos mostrando los resultados en escala logaritmica, ahi hace falta normalizar cada valor a la media geometrica de las replicas en la condicion de referencia. Eso es simplemente para centrar la media de la referencia en el 0 (escala log). Ahora bien, creo que vos me preguntas por las replicas tecnicas de cada gen para una dada condicion y una dada replica. En ese caso, los valores necesariamente tienen que ser similares entre si (o incluso, iguales), por que solo influye el error de pipeteo. Mas aun, solo deben considerarse validas estas replicas tecnicas si al diferencia de CTs es menos a 1, es decir, los N0 son menos del doble entre ambas replicas tecnicas. Si bien los resultados de usar media aritmetica o geometrica para valores tan cercanos va a ser muy similar, dada esta similtud esperable en valor es que no tendria sentido usar la media geometrica para este paso. Espero haber sido claro, saludos!

Sí, super claro!!! Muchas gracias!! Te pongo en los acknoledgements si alguna vez llego a publicar algo de esto jaja

@@florenciabogino7732 jajaja no hace falta. Abrazo!

Hi! Cellpose only generates the segmentation, i.e., the identification of the cells in this case. You can then take the segmentation and quantify your calibrated images in microns using software like Fiji/ImageJ, as is shown in this video. See that the images used for quantification are calibrated, so the measurements are in microns. Go to this link for more information: labelstorois.github.io/​. Have a nice weekend!

Hola! Lo importante es siempre correr el bloque de condiciones para un dado gen todo en la misma placa. (es decir, para el gen A, condicion 1,2 y 3, siempre en la misma placa y no separarlo). Luego, podes usar los valores de los housekeeping (incluso corridos en otra placa distinta) para normalizar los valores de tu gen de interes. Saludos!

Thank you! Cellpose was developed by Carsen Stringer and Marius Pachitariu. You should check their publication (link below the video). Good luck!

Also, check out our biorxiv (hopefully soon to be published) article showing how to use it in combination with ImageJ (in this case, for muscle segmentation, but the plugin can be used for any kind of cellpose segmentaiton): www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.01.20.427432v2).

Hola Laura. Lo podes bajar de acá: www.medischebiologie.nl/files/ Antes estaba más fácil de encontrar. Suerte!

@@MsWaiso muchas gracias!!

Gracias! Hoy en día existen otras alternativas que usan inteligencia artificial y que funcionan impresionantenente bien y son muy fáciles. Te recomiendo buscar el plugin Stardist para imageJ. Segmenta núcleos muy muy bien. Suerte!

Hola! La verdad ni idea. Me pregunto si tendra que ver con el excel y la configuracion (comas o puntos para decimales), pero quizas no sea eso. Lo probaria por las dudas en otra computadora a ver si te sigue pasando lo mismo. Exitos!!

@@MsWaiso exactamente yo tengo el mismo error y ya no pude analizar nada :(

Buenas! Sin duda, hoy en día para segmentar nucleos, yo iría por Stardist, un plugin de Fiji/ImageJ entrenado con redes neuronales y que funciona de maravilla! imagej.net/StarDist Espero que te sirva, saludos!

Si! Pero te recomiendo siempre trabajar con tif u otros formatos que no compriman la imagen como lo hace el jpg, ya que perdes información. Saludos!

resultados crudos sería

datos crudos*

Me pasa lo mismo al analizando mis datos, disculpas ¿Como lo resolviste?

Hola, como estas? Depende de lo que quieras medir, pero en la mayoria de los casos uno mide valores medios, dado que le interesa una medida de la "concentracion". Pero de nuevo, depende la pregunta. Por ejemplo, si te interesara cuantificar el DAPI para tener una medida del contenido N o 2N del nucleo (similar al ioduro de propidio en citometria), en ese caso te interesa la fluroescencia total. Con respecto a la formula que mencionas, antes que nada siempre antes de cuantificar hay que restar el background de la imagen (por ejemplo, en FIJI midiendo la fluorescencia en varios lugares donde no hay celulas, promediando ese valor y luego restandolo a toda la imagen). Eso hay que hacerlo estemos midiendo el valor medio o la fluorescencia total (integrated density en imageJ). La cuenta que vos mencionas, <<CTCF = Integrated Density - (Area of selected cell X Mean fluorescence of background readings) >> es la que te da el valor total de fluorescencia pero en imagenes a las que no se les restaron el background. Fijate que, justamente, lo que hace esa formula es restar el background a tu medicion especifica. En ese sentido, es mas sencillo restar el background a la imagen entera y, si lo que queres es medir fluorescencia total, directamente usar el valor "integrated density". Espero haber sido claro! Saludos y suerte!

Hola Elisa, supiste cómo se llama este método de análisis?

Hola Natalia. Si, la importancia de mantener el mismo threshold es siempre dentro de un mismo gen (o par de primers mejor dicho), en una "altura" en la que cruce a todas las curvas de ese gen en la parte exponencial (o lineal cuando se transforma a log). ¿Por qué se hace esto? Porque manteniendo el mismo threshold uno puede comprar directamente los valores de los Cts (muy importante para el método delta delta Ct). Nosotros con este método no vamos a darle tanta bola a los Cts, porque hacemos los cálculos con los "valores teóricos iniciales" de un dado transcripto (los N0s) y no con los Cts. En nuestro caso, si no me equivoco y si bien esto no se hace en la práctica, desde un punto de vista matemático creo que sería válido usar distintos thresholds para las distintas condiciones de un mismo gen (siempre respetando que ese threshold esté en la parte lineal de la curva). ¿Por qué? porque cambiando el threshold también cambia el Ct, pero en la cuenta de la PCR eso se compensa entre sí y siempre da el mismo N0. Esto último tiene sentido: el N0 es independiente de donde esté el threshold y depende sólo de la cantidad de inicial de cDNA de ese gen y de la calibración arbitraria de la fluorescencia del equipo. Entonces... si podríamos usar distintos threshold usando este método, ¿por qué el LinReg fija el threshold para un mismo amplicón? Quizás sea para que a partir de la tabla que nos da el programa, si así lo quisiéramos, podríamos sólo agarrar los Cts y usar el método delta delta Ct y no el de los N0s (algo que a mi criterio no es lo ideal, ya que asumiríamos 100% de eficiencia de la reacción). Quizás haya algo que se me esté escapando a estas horas, pero entiendo que es así. Ya que estamos, cierro con una cosa más. Uno en general le importa ver cómo varia un gen ante distintos tratamientos, y no tanto comparar cantidades relativas de transcriptos de distintos genes en un mismo tratamiento. Pero ojo, si lo quisiéramos, esto ultimo se puede aproximar igualmente comparando los valores normalizados. Por ejemplo, un gen A tiene expresion normalizada de 3 en una condicion y otro B de 0.5, la interpretacion es que aproximadamente hay 6 veces mas transcritpos de A que de B, y todo referido a la cantidad "abstracta" que es el promedio geometrico de los housekeepings. De nuevo, esto no es lo que se suele analizar, pero siempre puede ser util saberlo, porque es una capa mas de informacion que me ha sido util en muchisimas oportunidades. Y en un ejemplo asociado, los valores normalizados de un gen en una condición me da siempre lo mismo trabajando en 3 laboratorios distintos, con distintas termocicladoras, con distintas master mixs de real time. ¿Cómo se explica esto? Si el valor normalizado del gen Nanog en células madre es 3, implica que, en promedio, hay 3 veces más transcriptos de Nanog en estas células que el promedio de los housekeepings. Independientemente del valor, tiene sentido que "la célula" siempre "regule de manera similar" las cantidades relativas de los mRNAs de los distintos genes en un dado estado celular. Por eso es que los valores normalizados son muchas veces más informativos que los relativizados a la condición control. Espero que se haya entendido! Un abrazo y suerte

Hola Celia, gracias por tu consulta. Por lo que muestro en el video 3, la aplicación de la escala logarítmica ayuda a la visualización de los datos de qPCR: hace que las condiciones en las que un gen sube y baje sean simétricas (versus la escala lineal), y ayuda a visualizar casos extremos en los que, por ejemplo, si un gen sube muchísimo hace que otras condiciones donde ese gen sube un poquito nomas en comparación con un control no se vean en el grafico y eso conlleva a posibles errores de interpretación. En casos donde la subida o baja de genes es relativamente poca (por ejemplo, 2 veces para arriba o 2 veces para abajo) es menos grave visualmente no aplicar escala log, aunque nunca va a venir mal aplicarla. Esto me lleva a un consejo importante: siempre explorar los datos, ver que pinta tienen en escala lineal, después ver que pinta tienen en escala log, recordando que el objetivo de los gráficos es maximizar la información que se representa visualmente. Y como agregado, cuando uno ve que las barras de error en un grafico son mayores cuando el valor de la media en ese punto es mayor, es decir “cuando el error aumenta con la media”, una transformación logarítmica probablemente mejore esa visualización y haga que la varianza entre todas las condiciones sea mas similar. Con respecto a tu pregunta puntual, si, yo use dos estrategias distintas: (a) cambiar la escala en el grafico o (b) transformar los datos a log y graficarlos sin transformar la escala en el grafico. Técnicamente, estas dos variantes dan lo mismo, pero con una leve diferencia. Si uno quiere mostrar todos los puntos de las replicas biológicas, es indistinto cual usar: la diferencia es que para relativizar a la condición control, si usas el método (a) tenes que dividir todos los datos por la media geométrica de los puntos de la condición control, mientras que si haces el método (b) tenes que restarle a todos los datos la media aritmética (o sea, la media convencional) de los puntos de la condición control. Esta diferencia entre dividir en un caso o restar en el otro es porque en escala logarítmica restar es como dividir en escala lineal. Ahora bien, en la mayoría de los casos, aunque esto a mi criterio es menos claro, uno grafica la media +- error estándar (ojo, no desvio estándar) de los datos. En ese caso, yo iría por la opción (b) por lo siguiente: si el error estándar lo calculas con los datos transformados a logaritmo, obtenes un error que al graficarlo es el mismo para arriba y para abajo del valor medio, como debe ser. En cambio, si usas el método (a) y relativizas todos tus datos por la media geométrica de los controles, luego calculas el error estándar de esos datos relativizados (pero en escala lineal) y lo graficas. Ahora, cuando apliques el cambio de escala en el grafico a log vas a ver que el error va a ser asimetrico para un lado y para el otro, lo cual no es correcto en este caso. Por ese motivo, yo en general sigo el método (b). Por otra parte, si bien en el video muestro como transformar las leyendas del eje Y para que sean fracciones, por ejemplo 10 o 1/10 para genes que suben o bajan 10 veces, ahora cada vez mas me convenzo (y se ve cada vez mas en los papers) que esa transformación de datos puede ser confusa para algunos. Entonces opto directamente por dejar los datos en escala log2. Si, alguien que ve el grafico y no sabe mucho de logartimos quizás lo encuentre confuso, pero es solo cuestión de acostumbrarse. Te recomiendo “jugar” un poco con los datos y que veas esas diferencias al aplicar un método u otro. Espero haber sido claro y que te sirva mi respuesta. Saludos!

@@MsWaiso Estimado Ariel, te agradezco enormemente por tu disposición y tu respuesta. Es totalmente clara y responde a mi inquietud. Muchas gracias por los tips. Los voy a tener en cuenta!! Te envío un cálido saldo y estamos en contacto por cualquier cosa.

Disculpá la demora. Si, yo uso el 365 y me anda bien. ¿Ya lo pudiste resolver? Saludos

@@MsWaiso Hola Ariel, cómo se llama este método? <Gracias>

Disculpá la demora. Jaja es lo que traté de hacer en esta serie de videos :P Saludos!

Buenas! Eso en el caso de mí máquina de real Time se hace directamente en el programa step one. Pero no estoy necesario. Lo único importante es que en el linreg, en la parte de amplicon groups, asignes correctamente casa primer a cada well. Saludos