[Basic Western blot 1/3] SDS PAGE
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- Опубликовано: 16 сен 2024
- 지난 번 올린 SDS PAGE 설명 영상 자막을, 대학원생, 전문가 수준으로 올려보았습니다. 이해 안 되시는 점이나 틀린 점은 댓글로 지적해주세요. :)
[BGM]
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🎵Music provided by 브금대통령
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![[Basic Western blot 2/3] Transfer](http://i.ytimg.com/vi/WnCEBuQooXQ/mqdefault.jpg)
![[Basic Western blot 2/3] Transfer](/img/tr.png)
좋은 영상 감사합니다. 구독 하고 가요.
감사합니다 😁 좋은 하루 되세요
도움 많이 됐습니다. 감사합니다!
감사합니다! 🥰 궁금한게 있으시면 언제든 댓글로 질문 주세요 🙇🙋
안녕하세요! 좋은영상 감사합니다.
혹시 로딩버퍼에 일반적으로 ss본드를 끊어주는 reducing agent가 다 들어있나요? 아니면 그냥 리니어하게만 만들어주고 gel-run을 시키시나요?
항체를 분석시 ss가 끊긴거랑 안끊긴거랑 차이가 날것같은데 항체자체를 wb하실땐 어떻게 하는지 궁금합니다.
보통 ss bond를 끊어주는 agent가 들어있습니다 ㅎㅎ 저희는 혹시 모르니 구매 전에 포함된 agent를 전부 확인하고 사는 편입니다.
그리고 저희 연구실에서는 항체 자체를 western blot을 하진 않습니다. ㅠㅠ 만약에 하게 된다면 anti-Ab IgG의 epitope 부분만 확인을 할 것 같네요. 😄
답변이 도움 되셨길 바랍니다 🙆🏻♂️🙇🏻
6:16 size marker는 한 well에 모두 loading하는 것이 맞나요? … 그리고 샘플 제조시 buffer 적정량은 샘플양에 따라 달라지나요?
size marker는 보통 한 웰에 로딩합니다. 간혹 젤을 2개로 나누는 경우 2개 웰에 로딩하실 수도 있어요! 버퍼는 보통 5X, 2X로 농축되어있기 때문에 샘플양에 따라 달라집니다.
Ex. 5X 샘플버퍼로 2개 웰에 20 uL 넣어야 한다면?
20 uL보다 여유롭게(+5) 25 uL 만든다고 가정하고,
5X=25 uL, X=5 uL
샘플버퍼 5 uL + 샘플 20 uL = 25 uL 만드신 다음, 10 uL씩 웰에 로딩해주시면 됩니다.
로딩할 때 저는 기포가 생기면서 밖으로 흘러 나가는데, 로딩 시 대학님은 파이펫을 2step으로 꾹 눌러주고 홈에서 빼시나요? 또 저는 로딩하고 전압을 주면 내려가는 밴드선이 휘어지는데 얘는 왜그러는걸까요ㅜㅜ 또 웨스턴까진 마커가 이쁘게 내려오는데 트랜스퍼만 하면 멤브레인에 마커 모양이 들쑥날쑥해요ㅜㅜ 어떤 마커는 아래로 꼬꾸라져있고 어떤건 물결모양이고 난리부루스인데 얘는 왜그러는걸까요ㅜㅜ 질문이 많아 죄송합니다ㅜ
콩두리님 이거는 제가 예전에 석사 초기때 겪었던 문제라 상세히 도움을 드릴 수 있을 듯 합니다. 여기에 적기엔 좀 양이 많아서 redberry1245@naver.com으로 메일 주실 수 있으신가요? 자세히 알려드리겠습니다 😊
@@ThisIsGraduateStudent 안녕하세요 이미 몇개월이 지난 댓글이지만 저도 정확히 똑같은 문제를 겪고 있어서 찾아보다가 여기까지 오게 되었습니다 ㅜㅜ 혹시 실례가 되지 않는다면 시간 되실 때 저도 내용 공유받을 수 있을까요?
@@kaminoprototype 네네!! 혹시 메일 보내주실수있나요?? 😄
영상 감사합니다. Protein extraction과 샘플별 농도 맞추기는 어떻게 하셨을까요?
헐 제가 왜 이제서야 댓글을 본거죠??? 왜 알람이 뜨진 않앗던걸까요??? ㅠㅠ 정말 죄송합니다 무조건 답글 달아드리려고 노력하는데, 제가 확인을 못햇나 봅니다 ㅠㅠ
우선 저는 protein extraction은 RIPA buffer를 사용하고 있구요, 샘플별 농도 맞추기는 단백질 정량을 하기도 하지만 주로 일단 웨스턴 해보고 GAPDH가 비슷하게 나오면 그냥 사용하는 편입니다. GAPDH가 다르게 나오면 densitometry를 돌려보거나 아니면 GAPDH에 맞게 로딩양을 조절하는 편입니다. 저는 단백질 정량이 옳다고 보는데, 뭐 정량값이 그때그때마다 상이하게 나오는 편이다보니 잘 쓰진 않긴 합니다. 답변이 되셨을까요? 🥰
안녕하세요! 영상 보고 많은 도움 받고 있습니다. SDS-PAGE 할 때, 시간을 설정하는 기준이 어떤건지 궁금해서요. 옆에서 계속 보고 조정해줘야 하나요??
안녕하세요, 해원님! 물론 말씀하신대로 가장 좋은 방법은 옆에서 지켜보면서 조정하는 방법입니다! 하지만 그런 여유도 없고 바쁘잖아요 그쵸? 기준을 알려드릴게요 😊
가장 큰 포인트는 전압, 시간, 온도, 3가지입니다. 단백질이 변성되지 않게 온도를 낮게 유지하면서, 시간은 오래 걸리지 않게 전압을 적절히 올려야 합니다. 충돌하는 개념은 아래 2가지와 같아요.
1. 전압을 세게 하면, 시간은 줄지만 온도가 올라가죠. 2. 반대로, 전압을 약하게 하면, 온도는 내려가는 대신 시간이 오래 걸립니다.
그러면 이걸 어떻게 잡느냐, 전압은 80-120 V (보통 100)로 세게 잡으시되, 온도를 잡기 위해 차갑게 냉장한 Page buffer와 ice pack을 쓰는 겁니다. 그러면 시간과 발열, 두 마리 토끼를 모두 잡을 수 있죠. 저는 저러한 조건에서 100 V, 60-120 min 정도 내립니다(10% gel 기준).
60-120 min이라고 시간을 정한 기준은 '내가 원하는 kDa의 단백질 밴드가 젤 중앙에 도달할 때'입니다. Size marker가 이쁘게 잘 펼쳐지고, 단백질 밴드도 중앙에 위치하면 나중에 detection하기에도 편하죠. 제 기준은 그러합니다. 간혹, stacking gel 전압 따로, resolving gel 전압 따로 거시는 분들도 계신데, stacking gel 통과 여부는 size marker가 펼쳐지기 시작하는지 보시면 됩니다. Size marker는 stacking gel을 빠져나온 순간부터 ladder 형태로 펼처지기 시작하거든요. 그걸 기준 삼으시면 됩니다. :)
혹시 더 궁금한게 있으실까요? 😉
@@ThisIsGraduateStudent 빠른 답변 너무 감사합니다 🥹🥹 너무 도움이 많이 되고 이해도 잘 됐습니다!!
혹시 하나만 더 여쭤보자면 시간을 너무 오래 설정해서 protein이 gel 맨 아래까지 나려가게되거나 protein이 gel을 통과해서 빠져나가도 단백질 관찰이 가능할까요?
@@Prettyprince978 ㅋㅋㅋ 수십개 물어보셔도 괜찮습니다. 😄
질문하신 내용 중에 답이 적혀있어요! 단백질이 젤 아래로 빠져나가면 당연히 관찰할 단백질이 사라진 것이니 관측이 불가능해집니다. 아마 그 단백질은 page buffer에 둥둥 떠다니고 있을거에요. 만약에 단백질이 10, 20 kDa처럼 작은 크기가 아니라 100, 200 kDa으로 큰 크기면 젤에 간신히 남아있을 수도 있어요. 그건 Ponceau S 같은 단백질 염색약으로 젤을 염색해서 확인해보는 수 밖에 없습니다. 젤을 염색했는데 아무 밴드도 보이지 않는다면, 해결방법은 하나 뿐입니다. Western을 새로 하는거죠...저도 가끔 그런적이 있는데 포기합니다...ㅠㅠ
@@ThisIsGraduateStudent 으아아아악 그렇군요.. 감사합니다ㅠㅠㅠ 너무 감사합니다 최고예요 짱짱 👍👍💖💖💖
(실험 파이팅 합시다아.. 헤헤)
@@Prettyprince978 저에겐 구독자님이 더 쵝오..👍👍🥰🥰🥰 해원님도 실험 화이팅 하시구, 더 궁금하신게 있으시면 redberry1245@naver.com으로 메일 주세요. 웨스턴 프로토콜이나 필요하신 자료도 지원해드릴게요. 좋은 하루 보내세요 😉🙋
well에 sample들 넣을 때 피펫팁은 사이사이마다 갈아주는게 필요한가요?
네! 다른 샘플이라면 무조건 갈아줘야 하고, 같은 샘플일지라도 이미 EP buffer가 많이 묻어있어서 다음 샘플이 부정확하게 빨아당겨질거에요.
트랜스퍼 후 겔이 찢어지거나 멤버린에 하나도 안 옮겨지는건 뭐때문에 그런걸까요ㅠㅠ 속상합니당...
멤브레인 혹시 염색해보셨나요?? ponceau S 등으로 염색해서 쫘악 밴드가 있는지 검사해보세요. 만약에 단백질 밴드하나 없이 정말 깨끗하다면, 젤--> 멤브레인 방향이 아닌, 멤브레인-->젤 방향으로 트랜스퍼 된게 아닌지 의심됩니다.
혹시 전류, 시간은 어떤 조건으로 거시나요?? 🤔
안녕하세요 대학원생 어느 대학교에서 공부를 해요?
저는 연세대학교에서 공부하고 있어요 😄
@@ThisIsGraduateStudent 메일로 연락해도 되는지?
@@yerganat.h2497 네네 메일로 궁금하신 점 있으시면 언제든 연락주세요 redberry1245@naver.com입니다~
결과값은 어떻게 되나요?
웨스턴 전부 끝난 다음 결과 말씀하시는 건가요? 상피세포에 있는 단백질이 세균의 독소 (BFT, fragilysin)에 의해 2개의 단백질로 나뉘는 것을 확인했습니다. 마지막 영상에 결과 보시면 3번째 라인 아래쪽에 새로운 밴드가 뜨는걸 보실 수 있어요! 😁