안녕하세요. 꽤 이전영상이라, 답글을 달아주실진 모르겠습니다. 영상을 보다 궁금한점이 생겼는데요. cell counting을 통해, 4x10^6 cells/ml 이라는 것을 확인했고, '2x10^5 cells' 만 계대배양을 원한다면, 10ml 희석액에서 50ul만 따서 culture dish에 넣어주면 되는것으로 생각이 되는데요. 영상에서는, "넣고 싶은 세포수에 비례하는 양을 넣어야 하고", "아까 1ml이 아니라 10ml에 희석을 했으니 x10을 해서 '넣어야 한다'" 라고 말씀해주셨는데, 이 부분들이 잘 이해가 가지 않아 질문드리게 되었습니다. 1. "넣고 싶은 세포 수에 비례하는 양을 넣어야 한다"는 말이, 예시로 들어주신 2x10^5 cells 만큼을 배양하고 싶다면 50ul을 넣으면 되지만, 더 많은 양(ex. 6x10^5)을 원한다면 50ul x 3 = 150ul을 넣어주면 된다. 이런 의미로 말씀하신건가요? 2. "아까 1ml이 아니라 10ml에 희석을 했으니 x10을 해서 '넣어야 한다'"라는 말에서는 왜 x10을 해야 하는지가 잘 이해가 가지 않습니다. 예로 들어 주신 2x10^5 cells 만큼만을 배양하고 싶다면, 계산한 그대로 10ml의 희석액에서 50ul만을 따서 넣어주면 될 것 같은데요. 여기서 x10을 해서, 50ul x 10 = 500ul을 넣어주게 되면 2x10^6 cells가 들어가게 되는 것 아닌가요? 10ml의 희석액에 들어있는 총 cell 수를 count해주기 위해서는 당연히 10배를 해주는게 맞지만, "x10을 해서 "넣어야 한다" " 라는 말씀은, 새 culture dish에 넣어줄때, 넣어주는 양을 x10 해줘야 한다는 말처럼 들려서 질문드립니다!! 3. 그리고 영상에서는 거의 희석액 2ml를 따서 culture dish에 넣으시는 것처럼 보이는데, 해당 영상에서는 8x10^6 cells만큼이 필요하셔서 그만큼 넣으신건가요?
안녕하세요! 우선, 저도 영상을 다시 보면서 계산을 해보았는데, 카운팅을 잘못 한게 맞군요 ㅠㅠ 석사때 만든 영상이라, 군데군데 실수가 보입니다. 예리하게 잘 짚어주셔서 감사합니다. 그래도 아래에 다시 한 번 계산해보면서 차근차근 짚어보겠습니다. :) 1칸당 200개 = 200 CFU/0.1 uL Trypan blue 희석배수 x2 = 400 CFU/0.1 uL 400 CFU/0.1 uL = 4 x 10^2 CFU/0.1 uL = 4 x 10^3 CFU/uL = 4 x 10^6 CFU/mL 계산에 따라 우리가 가진 세포의 농도는 4 x 10^6 CFU/mL이며, 총 세포수는 4 x 10^7 CFU입니다. 우리는 10 mL에 희석하여 카운팅 했기 때문에, 실제 총 세포수는 4 x 10^7 CFU라고 생각해야 합니다. 만약, 원심분리된 세포 펠렛을 1 mL에 suspension했으면, 4 x 10^6 CFU이라고 계산했을 겁니다. 지금 위에 보시면 제가 단위를 CFU/mL이 아닌, CFU라고만 쓰고 있는걸 보실 수 있습니다. 세포 400만개를 10 mL에 희석하든, 100 mL에 희석하든, 농도(CFU/mL)는 달라지더라도 총 세포수(CFU)는 같기 때문이죠. 우리가 최종적으로 구해야하는 것은 총 세포수이기 때문에 한번 더 10을 곱해준 것입니다. 제가 만약 전체 세포 중 2 x 10^5 CFU를 심고 싶다면, 아래와 같이 계산해야 합니다. 분모는 4 x 10^6/mL을 쓰든, 4 x 10^7/10 mL을 쓰든 상관 없습니다. (2 x 10^5 CFU) / (4 x 10^6 CFU/mL) CFU 소거 = [(2 x 10^5) / (4 x 10^6)] mL = (2/40) mL = 0.05 mL = 50 uL 각 well당 50 uL를 seeding하면 됩니다. 1. 네, 맞습니다! 넣고 싶은 양을 부피에 비례-계산하여 넣으시면 된다는 뜻이었습니다. 잘 이해하셨어요. 2. 네 ㅠㅠ 제 실수가 맞습니다. 이 부분은 제가 댓글을 고정하여, 다른 분들이 볼 수 있도록 하겠습니다. 정확한 지적 정말로 감사드립니다. 3. 네네, 조만간 세포가 또 많이 필요했던 걸로 기억해서 1:5 정도로 seeding했습니다. 평상시에는 10 mL에 1:20 (0.5 mL) 정도로만 seeding합니다. 궁금한게 있으시다면, 언제든 댓글 남겨주세요. ㅎㅎ 좋은 하루 보내시기 바랍니다. 🥰🥰
@@무니-b7e 음... 이건 실험에 따라 다릅니다. 상대적으로 크기가 큰 콜로니를 얻고 싶다면 세포수를 적게 깔아서 오랫동안 키워야 하고, 크기가 작은 콜로니를 많이 얻고 싶다면 세포수를 많이 깔아서 조금만 키우는 등, 실험의 목적에 따라 세포 수는 달라집니다. 제 평균적인 실험 시딩 수는 5 x 10^4 cells/well (6 well plate 기준)이고, 다른 크기의 플레이트를 사용하면 또 그 숫자는 달라집니다. 처음에 여러 세포수를 10배수로 깔고(1x10^1, 1x10^2... 1x10^5, 1x10^6...) pilot test를 해보신 다음, 본인에게 가장 결과가 잘 나온다고 생각되는 세포수를 다음 실험부터 쓰시는게 좋습니다. 제가 말씀 드린 5x10^4도 그렇게 얻은 세포수입니다. 😊
01:15부터 나오는 화학식 설명에 빠진 점이 있어 추가해둡니다. NaHCO3 + H2O -> Na + HCO3 + H2O > Na + H2CO3 + OH- > Na + H2O + OH- + CO2 (빠진 부분) > Na + H2O + OH- + CO2 + H+ > Na + 2H2O + CO2 12:33 0.5 ml가 아니라 0.05 ml입니다! 죄송합니다. 다음부턴 좀더 신경쓰겠습니다. ㅠㅠ
영상에 담을 내용은 많은데, 분량은 조절하려다 보니 영상의 템포가 빠른 편입니다. 처음 보시는 분들은 0.8배속으로 이해하시면서 보시는 걸 추천드립니다. 1. 배지 confluency(세포가 차지하는 정도) 확인 - 보통 배지 표면의 80% 정도 자라면 하는 편입니다. 2. 적절한 confluency에 도달한 것이 확인되면 배지 가온. 3. 15~30분 후 재료(Conical tube, cell culture dish, pipette aid, serological pipette, Trypsin EDTA, DPBS without mg2+, ca2+, cell culture medium) 준비. 4. 기존 배지 석션. 5. DPBS 2~5 ml 분주 후 washing, 석션. 6. Trypsin-EDTA 2~3 ml 분주 후 37 'C incubator에서 30초~5분 가온. 7. 다시 꺼내와서 배지 8~7 ml(총 10ml이 되게) 분주 후 cell harvest해서 conical tube로 옮기기. 8. 1500 rpm, 3 min centrifuge. 9. pellet 빼고 석션. 10. 계산하기 편하게 적정량 배지 넣고 pellet 부유시키기. (10-1. Cell count하기.) 11. 적절한 양의 Cell을 새 배지에 seeding하고 incubator에 넣어주기. 12. 다음 날, 배지 갈아주기. 간략히 보고 싶으면 14:53으로 🙆🏻♂️
감사합니다 ㅠㅠㅋㅋ 문과 선생님들 덕분에 항상 메마른 감성을 채울 수 있죠. 저희처럼 정확한 결과가 필요한 '연구' 분야는 저렇게 세포를 하나하나 육안으로 세지만, 병원처럼 어마어마하게 많은 샘플이 있는 '진단' 분야는 세포를 기계로 셉니다. 기계보다 눈이 정확한 이유는 기계의 경우 세포가 죽고 남은 찌꺼기도 살아있는 세포라고 착각하는 경우가 많기 때문입니다. 그래서 눈으로 하나하나 보고 세는게 오히려 더 정확합니다 ㅋㅋ
@@MagicianYoung 오 제약 바이오에 들어가셨군요. 저도 한 때 들어가고 싶었던 분야라, 얼마나 노력하셨을지 느껴집니다. 정말 고생 많으셨겠어요. 혹시라도 궁금하신 게 생기신다면 언제든 오셔서 메일이나 댓글 남겨주세요. 완벽히는 못하더라도 잘 이해될 수 있게 도움 드리겠습니다 😊
안녕하세요 저는 고등학교에서 대장암 세포 LoVo를 배양하는 실험을 진행하려하는 한 학생입니다. 한국세포주 은행에서 세포주를 분양받으려하는데 Pellet Service를 통해 분양받을시 본 영상의 9:10 부터 실험 진행하면 되는것일까요? 배양 실험이 처음인지라 궁금하여 여쭈어봅니다
안녕하세요! LoVo 세포를 배양받으려 하시는군요. 하지만 배양이 목적이시라면 pellet service는 선택하시면 안됩니다! 배양이 목적이시라면 동결보존 세포를 받으시거나, 배양용 세포를 받으셔야 합니다. Pellet service는 말그대로 세포를 원심분리해서 모으고, 그 덩어리(pellet)를 제외한 상층액을 제거하여 보내주는 서비스입니다. 세포는 수분 보존이 필수적이기 때문에 pellet 형태로 오는 세포는 전부 죽은 세포라고 보셔도 무방합니다. 다시 배양을 시도해도 안 자라거나 이상하게 변질되어 자랄 가능성이 큽니다. 그러면 pellet service는 왜 하느냐, 그저 특정 세포 안에 있는 핵산이나 단백질 같은 기타 물질을 뽑아내기 위해 신청하는 서비스입니다. 이 경우, 굳이 살아있는 세포를 받을 필요는 없죠. 어차피 물질을 세포로부터 수확하려면 세포를 터트려 죽여야 하니까요. 😊 배양 가능한 세포를 받으신 다음에는 우선 동봉된 설명서에 적힌대로 따뜻한 배지(RPMI, DMEM 등)를 섞으셔서 1차로 많은 양을 불리신 다음, 대부분은 얼리고 남은 세포들을 가지고 실험 및 계대배양(영상과 같이) 하시면 됩니다. 그리고 가장 중요한 것은 LoVo cell의 현미경 사진을 찍으셔서, 인터넷에 나온 세포의 모습과 일치하는지 확인하세요. ATCC나 세포주은행이나, 내가 받은 세포가 진짜 원하는 세포인지 보장하진 않습니다. 세포은행은 그저 세포를 보관만 해줄 뿐입니다. 세포가 실제로 내가 원하는 종류가 맞는지는 꼭 외부업체에 맡기시거나 본인이 직접 확인을 거친 다음에 실험에 임하셔야 합니다. 😊 더 궁금한게 있으신가요? 언제든 질문해주셔도 좋습니다. 화이팅입니다!! 🥰
@@ThisIsGraduateStudent 그렇다면 서비스중 Fellet 이외에 DNA extraction service 가 있었는데 해당 service는 무엇인지 알수있을까요?! Fellet이 아니라면 해당 service를 선택해야 하는건지 궁금합니다😢 바쁘시면 답변 안주셔도 됩니다ㅎ 친절하신 답변 너무 감사드립니다😊
@@만숭 DNA extraction service는 LoVo 세포를 핵막까지 다 터트린 다음 DNA만 뽑아내서 보내준다는 서비스입니다. Extraction은 (특정 성분의) 추출을 의미합니다. 살아있는 세포를 받으시려면, 아마 학교에서 연구 목적으로 사용하실테니 비영리 동결(frozen) 또는 비영리 배양(culture)을 선택하셔야 할겁니다. '동결'은 얼어있는 세포스탁을 받으시는 거고, '배양'은 녹이는 과정 없이 바로 계대배양할 수 있게 플라스크에 배양되어 오는 세포를 말하는 겁니다. 😊
@@MagicianYoung ㅋㅋㅋ그쵸 요즘 잠시 핫했던 초전도체도 어쩌면 발명됐을 수도 있겠네요. 그 당시 금을 개발하려 했던 연금술사들이 기록에 진심이었던 과학자들인지라, 그 덕에 재료공학, 화학이 발전했으니 어쩌면 상온상압 초전도체가 발명된다면 그들이 시초라고 볼수도 있겠네요 😆
안녕하세요 저는 고1 학생입니다 제거 이번에 과학 수행평과로 세포배양 과정을 조사하고 있는데 교과서에서 산과 염기에 대해 배워서 교과서 심화로 인큐베이터에서 이산화탄소를 공급하는 이유가 ph조절에 있다는 것을 말하고 싶은데 동영상을 계속 보고 여러 자료를 찾아봐도 잘 이해가 안돼요 제가 가숙사에 살아서 질문할 사람도 없는데 참 난처합니다 혹시 co2 공급을 하는 이유와 화학식을 연결시켜 쉽게 설명해주실 수 있나요..?? 좋은 동영상 너무 너무 감사합니다 🙏
NaHCO3 + H2O ↔ (Na+) + (HCO3-) + H2O ↔ (Na+) + H2CO3 + (OH-) ↔ (Na+) + (OH-) + H2O + CO2 (NaHCO3 = sodium bicarbonate) 고등학생때 세포배양을 배운다니 되게 놀랍네요...🙊 우선 화학식은 위와 같습니다. 세포는 '배지 (Cell culture medium)'라고 하는 액체 속에서 배양을 하게 돼요. 그리고 거의 모든 세포들은 5 또는 10%의 CO2를 제공하는 37'C 인큐베이터 내에서 키웁니다. 우리가 숨쉬듯이 산소를 제공하는게 아니라 이산화탄소를 제공한다는게 이상하게 느껴질 수도 있겠지만, 5%라는 점에 잘 주의해야합니다. 왜냐하면 우리가 100% CO2를 주는게 아니기 때문에, 인큐베이터 내에도 산소가 있고 세포는 이걸 이용하기 때문이죠. 세포는 성장, 증식하면서 산 (H+) 물질을 배출합니다. 즉 똥을 싸는 거죠. 그렇기 때문에 이 산을 중화시켜주기 위해서 염기성 물질(OH-)을 만들어줘야 합니다. 이 염기성 물질을 만들어주기 위해 배지에 들어있는 물질이 sodium bicarbonate와 HEPES라는 물질입니다. 그리고 이 두 물질은 CO2가 있어야 염기성 물질을 만들어낼 수 있기 때문에 CO2를 제공해준답니다. 😊 CO2를 제공 받은 sodium bicarbonate와 HEPES라는 물질는 위의 화학식을 거쳐서 OH-를 만들게 되고, 이 OH-는 세포가 만들어낸 H+와 만나 H2O, 즉 물이 됩니다. 그래서 중성이 유지되는 거죠.🙋🏻♂️ 이해가 됐나요? 혹시 더 궁금한게 있다면 언제든지 맘껏 물어봐도 좋습니다. 😄🙆🏻♂️
@@ThisIsGraduateStudent 정말이지 빠르고 깔끔한 답변 너무 감사합니다 훨씬 이해하기 쉬워졌어요 근데 아직 배움이 짧아 그런지 궁금한게 있는데요, 바보같은 질문일 수 있겠지만 저 화학식들에서는 추가적인 이산화탄소 공급을 나타내는 부분은 없지 않나요? 저 식은 첫부분에서 탄산 수소 소듐???(NaHCO3)과 물의 결합으로 식이 이루어지는 것 아닌가요? 저기에 추가적인 이산화탄소의 공급으로 염기성 물질을 형성한다라고 볼 수 있는게 뭐예요???
@@승환위-s4y 오오 맞습니다. 사실 배지와 대기 간에 일어나는 화학적 변화에 대한 화학식이 너무 많아 여기 다 적어드릴순 없지만 ㅠㅠ 모든 조건은 CO2가 5%로 존재하는 환경 내에서만 일어납니다. 5%면 꽤 높은 이산화탄소 농도인데, 이 고농도의 포화된 대기 때문에, 배지 내에 있는 이산화탄소가 빠져나가지 못 하게 하는 역할도 있죠. 말씀 하신 내용, 전부 잘 이해하셨고 맞습니다.
세포배양이라는것이 세포를 외부의 환경에서 증식시키고 유지시키는 일로 알고있는데 혹시 위 영상에서 배양과정이 나오나요? 진짜 잘 몰라서 그러는데 위 영상은 세포를 dish에 옮겨 enubauer chamber에 넣고 수를 세는 실험같아서요...보고서 작성에 참고하려고 하는데 자세한 답변 부탁드립니다 ㅠ
아 위 영상은 세포 배양 중에 계대배양(서브컬쳐 subculture) 과정을 말하는 영상이에요. 세포 배양에 있어서 거의 필수적인 과정으로, 찬영님께서 말씀하시는 세포를 유지하는 과정의 끝이자 시작이라고 말씀 드릴 수 잇어요. 배양을 할 때는 따로 뭔가 해줄 필요 없이 그냥 CO2 incubator에 세포가 있는 dish를 넣고 기다리기만 하면 됩니다. 그래서 서브컬쳐 하는 영상만 올린 것이지요. 😁
안녕하세요 세포배양에 대해 조사를 하던 한 고등학생입니다 글로만 되어있는 자료에선 세포 배양에서 잘 모르겠는 부분이 많았는데 이렇게 동영상으로 보니 덕분에 이해가 잘 갔습니다 저희 고등학교에서 직접 실험을 해보고 싶었는데 아무래도 한계가 있어 주변에 있는 대학 연구소에 도움을 받고자 하는데 혹시 저같은 일반고 학생도 연구소에서 도움을 받을 수 있을까요? 그리고 만약 허락을 해주신다면 고가의 장비를 뺀 나머지는 저희가 다 준비해서 가야하는 건가요 아님 안그래도 되는건가요? 이런 경험이 처음이라 이런 기초적인 질문을 드리게 된 점 정말 죄송합니다
안녕하세요, 조수빈 님. 아마 고등학교에서 이러한 도움을 대학 연구실에 얻고자 하실 경우, 과학 담당 선생님께서 연구실 담당 교수님과 따로 연락을 하여 일정 조율을 하는 것이 일반적인 관례입니다. 저같은 대학원생도 어떻게 보면 제 개인용품이 아니라, 교수님 연구실에 소속되어 물품을 '빌려' 사용하는 것이기 때문이죠. 그래서 예의상 선생님과 교수님 간에 연락을 하심이 옳은 것 같습니다. 장비 대여 같은 경우는 교수님 성향상 허락해주실 수도 있고, 아닐 수도 있는데, 이건 교수님 성격에 달려있는 거라 참 말씀 드리기 어렵네요. 제 연구실이라면 얼마든지 빌려드리고 싶지만, 저희 연구실은 조금 힘들듯 합니다 ㅠㅠㅠ 죄송하네요. 고가의 장비를 제외한 나머지 품목들 또한 준비를 해오시기에는 조금 어렵지 않으실까 싶습니다. 장비 보다는 저가라고 해도, 다들 가격이 개당 5000원이 넘는 고가이기 때문이죠. 물품을 들고 온다기 보다는, 저희는 ㅇㅇ같은 연구 및 실험을 해보고자 합니다. 이러한 연구를 하기 위해서는 ㅇㅇ한 실험을 해야할 것 같은데, ㅇㅇ한 실험에는 이러이러한 재료가 필요합니다. ㅇㅇ한 재료 중 일부는 저희가 갖고 있으니, 나머지 장비에 대해 대여하고자 합니다. 이런 식으로 구체적인 실험 계획을 구상해 가는 것이 보기에도 설득하기에도 더 좋겠죠?? 😊 저도 이런 기초적인 질문에서 성장을 하고 여기까지 올라온 과학자입니다. 전혀 죄송하지 않으셔도 돼요. 모르거나 생소한 것은 죄가 아닙니다. 알려고 용기내어 노력한다는 건 대단한 거죠. 앞으로의 실험에 좋은 결과가 있길 바랍니다 ㅎㅎ 혹시 세포 배양에 궁금한 점이 있으시면 redberry1245@naver.com으로 메일 한번 주세요. 도움될 수 있으면 자세히 알려드리겠습니다. 🙆🙋
실험 경력이 없는데 실험을 하게된 ㅠ.ㅠ 비운의 1인입니다. 셀카운팅이 막혀서 조언을 구해보고자 질문을 합니다. 죄송합니다. -100파이에서 키워진 셀을 25T 플라스크에 옮겨 담아야 하며 25T 플라스크는 5ml의 메디아가 있고 그 곳에 1*10^6 씩 셀을 넣어야 함. - 트립신 10 ul : 세포 10 ul - 메디아 1ml 로 셀커운팅 진행시 258 나옴 ( 헤모~ 4군대 세어준 상태 ) -129 x 10^4 : 1000 = 1*10^6 : x x = ( 1000 * 1*10^6 ) / 129 x 10^4 x = 775 -t25플라스크에 메디아 5ml 뿌린 곳에 셀을 775ul 을 넣으면 1*10^6 으로 넣게 된건가요? - 셀카운팅하고 나온 수를 메디아 5ml 뿌린 곳에 1*10^6 식으로 넣어야 하는데 여기서 부터 어떻게 계산하는지 막혀서요 ㅠ 여기 동영상보며 열심히 실습하고 있습니다 항상.감사합니다
일단 먼저 감사하다는 말씀 드립니다 ㅎㅎ 🥰 hemocytometer에서 4군데를 센 결과 258이 나왔다면, 258/0.4 ul라고 볼 수 있습니다. 1칸이 0.1 ul를 의미하거든요! 우선 258÷4를 하셔서 1칸의 평균수를 구합니다. 258÷4=64.5 --> 64.5/0.1 ul trypan blue에 1:1 희석된 거기 때문에 2배를 해줍니다. 64.5/0.1 ul --> 129/0.1 ul 1 ml에 희석하셨기 때문에 x10^4을 해줍니다. 129 x 10^4/ml --> 1.29 x 10^6/ml 넣어야 하는 세포 수를 가지고 있는 세포 수로 나누면~ (1.0x10^6)/(1.29×10^6) = 1/1.29 = 0.7751... 셀을 1 ml로 섞으신 곳에서 775 ul를 25T 플라스크로 넣으시면 1x10^6을 넣으신게 맞습니다! 검산을 해보니 댓글에 작성해주신 계산 과정이 정확합니다. 계산 하실 때 플라스크에 이미 넣으신 5 ml은 신경을 쓰지 않으셔도 됩니다. 5 ml을 넣었든 500 ml을 넣었든, 세포의 수는 변하지 않으니까요. 세포를 몇 ml에 희석해서 계산하셨는지 그것만 신경쓰시면 됩니다. 계산 너무 잘 하셨습니다. 그리고 25T 플라스크에 5 ml은 조금 적다는 생각이 듭니다. 권장량은 15 ml이고, 저희 연구실에서는 10 ml 이상을 넣어주고 있습니다. 짧게 키울 예정이시면 상관 없지만 플라스크 제조사 홈페이지로 가셔서 적정 배지 용량을 살펴보시는게 좋을 듯 합니다. 저도 아무 관련 지식이 없는 상태에서 실험을 시작했던 사람입니다. 공부하시다 보면 금방 쑥쑥 느실거에요. 실험의 스킬보다는 이 실험을 왜하는지, 논리 및 가설에 초점을 맞춰서 하시다 보면 정확한 실험을 하실 수 있을 거에요! 잡담이 길어졌네요 ㅎㅎ 좋은 하루 되세요 🙆♂️🙇🙋♂️
답변 감사합니다. ㅠ 셀카운팅 문의가 더 있는데요. 1. 셀을 계산했을때 변환한 값이 예를 들어 제가 뿌려야 하는 양이 1 *10^6인데 , 3 × 10^4 라던가 6 * 10^7 이라던가 했을때도 넣어야 하는 세포수에서 가지고 있는 세포수를 나누면 되는거죠? 2. 여러개의 티플라스크에 뿌리고 싶은경우에는 기존에 디시를 여러개 만드는 수 밖에 없겠죠? 바쁘실텐데도 소중한 답변 달어주셔서 감사합니다!
@@dream3345 1. 네 맞습니다! 분모와 분자는 변하지 않아요 ㅎㅎ 2. 저는 그래서 세포를 계대배양할 때 커다란 곳에 많이 키웁니다. 얼마가 필요할지 모르니 150파이 디쉬, 75T 플라스크를 여러개로 넉넉하게 키워놓죠. 그리고 세포를 처음에 심는 양을 다르게 해서 매일 완성된 디쉬가 나오게 해놓아요. 예를 들어서 1개 심은 디쉬, 2개 심은 디쉬, 4개 심은 디쉬, 8개 심은 디쉬. 이런식으로 디쉬를 만들면 세포가 자라면서 2배수로 늘어나니까 매일 꽉찬 디쉬를 8개, 4개, 2개, 1개 심었던 순으로 나오게 되죠. 헤헤 실험 처음 하시는데도 질문 수준이 꽤 높으셔서 깜짝 놀랐습니다. 항상 화이팅입니다 💜🙇🙋♂️
@@ThisIsGraduateStudent 답변 감사합니다! 기존에 새로 만드는 디시에 메디아가 미리 뿌려져 있다는 부분에 꼿혀서 진짜 많이 헷갈렸는데 헷갈림이 확 가셨어요! 100파이 디쉬에 셀을 좀 많이 뿌려서 나중에 디시 하나로도 25t 플라스크 여러개 만들수 있도록 하려구요! 답변 감사합니다. 항상 좋은 정보 감사합니다!
계산 매번 헷갈리는 드리미 입니다. migration / invasion assay 실험을 하게 되었는데요. 프로토콜만 받고 하는데 암튼 미치고 있는 중입니다. ㅠ upper chamber 뿌리는 양이 헷갈려 문의 드립니다. 왜 자꾸 계산이 헷갈리는지. 흑흑 ㅠ_ㅠ 프로토콜에 보면 upper chamber에는 1×10^4 , 2×10^4, 3×10^4 으로 씨딩을 하되 200ul씩 넣어라 라고 되어 있더라구요. upper chamber에 뿌리기 전 1ml로 셀을 희석 후 카운팅을 하니 6.45×10^5 이렇게 나왔습니다. 그래서 저는 200ul 이니 1ml(1000ul)의 5분의 1이니까 나온 값의 5분의 1로 나눠봤는데요 645000 (1ml) ==> 129000 (200ul) 그리고 이 상태에서 1×10^4 , 2×10^4, 3×10^4 나눠야 하니 비례식으로 해서 아래와 같이 계산했거든요. 200ul로 나온 값 / 뿌리고자 하는 값 129000 / 10000 ( 1×10^4 ) 1×10^4 ==> 12.9ul upper chamber 씨딩 나머지는 SFM 넣어 200ul 만듦 129000 / 10000 ( 1×10^4 ) 2×10^4 ==> 6.45ul upper chamber 씨딩 나머지는 SFM 넣어 200ul 만듦 129000 / 10000 ( 2×10^4 ) 2×10^4 ==> 4.3ul upper chamber 씨딩 나머지는 SFM 넣어 200ul 만듦 129000 / 10000 ( 3×10^4 ) 저런 식으로 계산해서 upper chamber에 넣었는데 이게 점점 제 자신에 대한 의심이 들어서요 ㅠㅠ 잘 넣은 건가..삽질한건가.. 싶어서요 ㅠㅠ
1000 ul를 200 ul로 바꿔서 하신 부분은 조금 오류가 있는 듯 하여, 제가 하는 방식을 알려드리자면, 저는 아마 멸균된 EP tube 3개를 준비한 다음, 1 ml에서 제가 가져올 세포양을 먼저 계산했을 겁니다. 1x10^4 그룹을 예로 들자면, 6.45x10^5개의 세포에서 1x10^4을 채취하려면, 1x10^4 / 6.45x10^5 (ml) = 1 / 6.45 x 10 = 1/ 64.5 = 0.0155...(ml) = 15.5 ul 제가 6.45x10^5개의 세포가 있는 1 ml에서 1x10^4개의 세포를 취할려면, 1 ml에서 15.5 ul를 파이펫으로 뜨면 된다는 뜻입니다. 15.5 ul 안에 1x10^4이 있다는 얘기죠. 그리고 아까 준비해 둔 EP tube에 serum medium 184.5 ul를 넣고, cell 15.5 ul를 넣어서 잘 섞어줄겁니다. 이렇게 합쳐진 200 ul를 upper chamber에 분주하겠죠. 나머지도 똑같이 계산에서 200 ul로 맞춰준 다음 넣을 겁니다. 혹시 upper chamber에 serum medium이 아닌 serum free medium을 넣으시는 건 어떤 시약을 추가해서 넣으시려는 의도이신 건가요? Serum free medium을 migration assay에서는 잘 사용을 안 해봐서요 🤔 암튼 한 번 읽어보시고 또 궁금한거 있으시면 댓글 달아주세요 😊🙇
@@ThisIsGraduateStudent 어메 이제사 저거 뿌리는거 이해가 확 갔어요! 그리고 저 셀 씨딩 다 잘못했네요. 허허허허 저는 ep tube에 안놓고 업퍼챔버에 그냥 뿌렸는데 선생님 방식으로 그렇게 해야겠어요! 프로토콜 받은거에는 아무것도 넣지 않은 일반 rpmi1640 넣으라 해서 업퍼챔버에 뿌릴때 그렇게 만들었었어요! 소중한 답변 감사합니다 :)
유산균도 비슷합니다! 하지만 세균은 액체배지만 사용하는 세포와 다르게 고체 배지도 사용하죠. 세균을 키울땐, 먼저 고체 배지에 키워서 내가 원하는 균이 맞는지 다른 균이 오염되진 않았는지 먼저 선별과정을 거칩니다. 여기서 내가 원하는 세균을 다시 한 번 고체 배지에 펴 발라서 양을 엄청 늘린 다음, 액체 배지로 옮겨줍니다. 본격적인 증균은 부피를 많이 늘릴 수 있는 액체배지에서 실시하고, 계대배양은 액체배지로 하는 것이 좋습니다. 유산균의 경우 자라는 속도가 빠르기 때문에, 조금 쉬고 싶다면 고체배지를 파라필름이라는 실링테이프로 밀봉하고 냉장 보관하는 것도 방법입니다. 냉장 보관만 잘 된다면, 한달 후에 계대배양을 이어서 해도 문제 없습니다.
세포수를 새어봤는데 세포가 360만개(5ml) 있다고 한다면 각 well에 20만개씩 분주하려고한다면 어떻게 계산공식을 해야할까요? 맨날 헷갈립니다.(그냥 나누면 되는것 같은데..) ㅠㅠ 저 영상에 나아있는 계산대로 하면 0.5ml이 아니라 0.05라고 나오거든요.. 저는 ㅠㅠ 단위가 안맞아서 그런건가요?..하 ㅠㅠ 셀카운팅기계 샀으면 하는데 ㅠㅠ
안녕하세요 ㅎㅎ 우선 영상 시청해주시고 이렇게 댓글도 달아주셔서 감사합니다. 5.0 ml에 세포가 360만개 있다고 하셨는데, 앞으로 세포 갯수를 적으실 때 3.6 x 10^6으로 적는 습관을 들이시는 게 좋을 듯 합니다. 논문에 기입할 때도 어차피 저렇게 적어야 하고, 0의 개수를 정확히 적을 수 있기 때문에 실수할 확률도 줄기 때문이에요! 자, 다시 돌아와서 3.6 x 10^6 cell이 5 ml에 있다고 하면, 계산은 다음과 같습니다. (내가 넣고 싶은 세포수) ÷ (내가 가진 세포수) = (넣어야하는 ml양) 의 공식을 쓰면 됩니다. 20만 ÷ 360만 = (2.0 x 10^5) ÷ (3.6 x 10^6) = 2 ÷ 36 = 1 ÷ 18 = 0.055...ml = 2.0 x 10^5 cells/0.055...ml 하지만 이 계산법에는 한가지 놓치기 쉬운 점이 있어요. 🤔 바로 0.055 cells/ml의 ml이에요. 이 공식은 선생님이 가지고 계신 360만개의 세포가 1 ml의 배지에 들어있다고 가정하고 계산된 것이에요. 그래서 같은 360만개의 세포가 1 ml이 아닌 5 ml에 들어있다는 것은, 5배 희석됐다는 의미와 같습니다. 그래서 0.055...x 5 ml의 양을 옮겨야 그 안에 20만개의 세포가 들어있게 되죠. 🙊 0.055... x 5 = 0.277... = 0.278 ml (278 ul) = 2.0 x 10^5 cells/278 ul (pipette loss 생각한다면 16 wells에 seeding이 가능하겠군요!) 제가 이런 복잡한 계산을 하기 싫어서 1 ml에 세포를 희석하자니 양이 너무 적어서 위험하고, 계산하기 편하려고 10 ml에 희석하자니 너무 세포가 희석되는 것 같고...😥 이러한 문제를 해결하기 위해서 만든 방법이 요 영상에 있습니다. --> ruclips.net/video/6YkYmR7QFZs/видео.html + 추가적으로 셀카운팅 기계는 병원, 연구소 등에서 다량의 세포 검체를 세야할 때 쓰는 것이지, 트리판 블루로 염색해서 손으로 카운팅하는 것이 가장 정확합니다! 실제로 세포를 카운팅해서 비교해보면, 기계보다 현미경 보면서 하는게 훨씬 정확합니다. 게다가 셀카운팅 기계는 주기적으로 Q.C.와 정비가 필요하기도 하구요. 기계는 너무 많은 양을 도저히 소화하기 힘들 때 사용하는 장비라는 점! 너무 맹신하지는 마세요. 🥰 ++ 영상 더보기 란에 제 인스타 아이디와 이메일이 있으니 궁금하신 점은 언제든지 이용해서 물어봐주세요! 최대한 제가 아는 선에서 도움드리겠습니다. 오늘도 행복한 하루, 맛있는 저녁 되세요 ㅎㅎ 🙋♂️
안녕하세요! 세포배양을 막 시작한 실험 초보자입니다! 영상을 보고 많은 도움을 받고있어요 ㅎㅎㅎ 그런데 혹시 media change를 배양 5일차 정도에 해주었을때 cell에 영향이 있을까요? 실험일정 조율이 불가할 경우가 있어서 혹시 세포에 문제가 생길까 걱정되서요..ㅠㅠ
media change를 할때는 규칙을 세워두시면 좋을듯 합니다. - 세포를 seeding한 다음 날 해준다 : Subculture에 의한 스트레스로 죽은 세포를 없애는 목적입니다 - Subculture 후 3일마다 media change해준다. : 보통 3일마다 배지 안에 있는 FBS 같은 영양분들이 세포들에 의해 고갈되기 때문에, 3일마다 해주는 것이 좋습니다. 세포를 구매하실때 받은 data sheet에 보면 몇일마다 배지를 갈아주는게 좋은지 나와있습니다. - 실험 전날에는 배지를 갈아주지 않는걸 권장드립니다. : Media change 후에는 일부 세포가 유실되기도 하며, 세포의 모양이 살짝 round해지는 등, 짧은 시간임에도 약간의 변화는 생길 수 있습니다. 어차피 media change의 목적이 죽은 세포를 제거해주고, 고갈된 영양분을 새로 채워주는 목적이니, 실험 12시간 전에 죽은세포가 별로 없거나, 배지가 노랗게 변하지 않았다면 굳이 media change를 해줄 필요는 없습니다. :) 실험일정 조율을 위해 세포에 미디어 체인지를 해주실 필요는 없습니다. 만약 조율이 불가하시다면 그냥 과감히 세포를 버리시고 새로 키우는 걸 추천드립니다. 왜냐하면 세포를 더 놔뒀다가 실험하거나, 급해서 일찍 해버리면, 본인이 원하는 세포 수보다 많거나 적은 상태에서 실험이 시작될수도 있기 때문이죠. 실험 12시간 전만 아니라면, 미디어 체인지 자체가 실험에 영향을 미칠만큼 세포에 큰 문제를 주진 않습니다. ㅎㅎ 궁금하신 점이 있으시면 언제든 댓글 또는 메일 주세요 😊
근데 궁금한게 있는데 배지 안에 들어있는 sodium carbonate가 배지의 물과 만나게 되면 HO-를 생성하는데 이는 세포에서 나오는 산성 H+와 만나 H20 물이 되기 때문에 산성화를 막을 수 있다. 고 하셨는데 이게 co2 를 넣어주는거랑 무슨 상관이 있는 걸까요? ㅜㅜ
sodium bicarbonate는 CO2 incubator가 발명되고 난 이후에 개발된 물질이고, 이전에 CO2 없이 세포를 키웟을때는 pH를 조절해주기 위해 HEPES라는 물질을 사용했었어요. 물론 sodium bicarbonate는 우리 몸에 있는 물질이라 세포에 데미지가 덜 하지만, 아무래도 완충 능력(buffering capacity)이 떨어지다 보니 HEPES를 같이 넣어 키워준답니다. CO2를 넣어주는 이유는 체내 혈액에도 저농도의 CO2가 섞여있기 때문인데요. (0.05%인지 좀 헛갈리네요.) 세포의 pH가 떨어지게 되면 sodium bicarbonate, HEPES 같은 친구들이 pH를 올려주는데, 여기서 CO2는 다음과 같은 역할을 하게 됩니다. CO2 유입 → CO2 + H2O → H2CO3 → 이 중 70%가 HCO3-, 즉 bicarbonate가 됩니다. 추가적으로 혈중은 저농도의 CO2가 있는데 왜 incubator는 5%라는 고농도의 CO2를 공급해주냐면, 바로 우리 몸은 스스로 대사를 조절할 수 있는 open system, 몸 밖의 세포는 외부환경에 대해 스스로 물질을 조절할 수 없는 close system이기 때문입니다. 그래서 조금 더 과잉으로 고농도를 넣어 안전하게 공급하고자 하는 것이죠. 찡끗ㅡ★
우선 댓글 달아주신 점 감사드립니다. 😆🥰 NaHCO3 + H2O ↔ (Na+) + (HCO3-) + H2O ↔ (Na+) + H2CO3 + (OH-) ↔ (Na+) + (OH-) + H2O + CO2 CO2가 5% 이하로 낮아지면, 위의 식에 따라서 OH-가 증가하게 되고, 따라서 pH는 증가하게 됩니다. 5%의 고분압 CO2는 세포에 CO2를 공급하는 목적도 있지만, 배지 속 CO2가 기화되지 못 하게, 인큐베이터 내 이산화탄소 분압을 포화시키는 용도이기도 합니다.
네, 안녕하세요! 답변드리겠습니다 😄 Cell culture라는 세포 배양 기술에는 크게 2가지 종류가 있습니다. Primary cell culture, Subculture가 대표적인 세포 배양인데요! Primary는 초대, 첫번째의, 원시적인, 이런 뜻을 가지고 있으며, 생명체의 몸에서 세포를 떼어내 처음으로 몸 밖의 세포배양접시 등에 옮기는 행위를 말합니다. 떼어낸 세포는 백혈구, 골수세포, 줄기세포 등과 같은 일반 정상세포가 될 수도 있고, 상피종, 육종 세포와 같은 암세포가 될 수도 있습니다. (물론 primary tissue culture라고 해서 조직을 심는 방법도 있어요!) Subculture를 설명드리면, sub의 뜻은 다음의, 아래의, 과정의 다음 단계 등과 같은 뜻을 가지고 있습니다. 아까 떼어낸 세포가 정상세포일수도, 암세포일수도 있다고 말씀드렸는데, 암세포를 굳이 떼어내서 사용하는 이유는, 물론 암을 연구하기 위한 것도 있지만 암세포 자체가 불멸의 세포이기 때문입니다. 암세포의 정의가 분열을 멈추지 않고 비정상적으로 끊임없이 분열하는 세포이니, 조건만 잘 맞춰준다면 죽지 않고 계속 배양을 이어나갈 수 있죠. (제가 키우는 암세포도 30년 넘게 살아있는 친구입니다.) 이에 반해 정상 세포는 줄기세포의 경우라 해도 분열을 5번 이내 밖에 못하고 금방 죽어버리고 맙니다. 그래서 매번 실험을 할때마다 쥐, 토끼 같은 생물을 죽여서 세포를 꺼내줘야 하죠. 정상세포의 경우 별로 서브컬쳐할 일이 없다고 치고 암세포의 경우로 subculture를 하는 이유를 말씀드리겠습니다. 암세포를 배양용 접시(cell culture dish)에 키우다 보면, 분열을 계속해서 언젠가는 접시를 꽉 채울만큼 수가 많아지게 됩니다. 세포는 본인이 자랄 공간이 더 이상 없게 되면 자살을 하기 시작하는데, 이로 인해 어느 정도 수가 자라면 그 중의 일부만 새 배양용 접시로 옮겨서 자랄 공간을 확보해줘야 합니다. 이렇게 기존의 꽉 찬 배양용 접시에서 새 배양용 접시로 옮겨주는 행위를 subculture라고 부릅니다. subculture하지 않고 세포를 방치할 경우, 결국에는 모든 세포가 비좁은 공간에서 다 죽고 맙니다.(좀 함축해서 얘기하자면 세포들끼리 여기 환경이 더 자라기에 여의치 않으니 서로 자살하자는 신호를 주고 받는 겁니다.) 요약하자면, Cell culture (세포 배양) 1) Primary cell culture = 세포를 처음으로 체외로 이식하는 행위. 2) Subculture = 세포를 유지시키기 위해 새로운 배양접시로 옮겨주는 행위. Primary cell culture --> subculture #1 --> subculture #2 --> subculture #3 ... --> subculture #n...
이전에 물어보신 분이 계셔서 달았던 답글을 가져왔습니다! :) NaHCO3 + H2O ↔ (Na+) + (HCO3-) + H2O ↔ (Na+) + H2CO3 + (OH-) ↔ (Na+) + (OH-) + H2O + CO2 CO2가 5% 이하로 낮아지면, 위의 식에 따라서 OH-가 증가하게 되고, 따라서 pH는 증가하게 됩니다. 5%의 고분압 CO2는 세포에 CO2를 공급하는 목적도 있지만, 배지 속 CO2가 기화되지 못 하게, 인큐베이터 내 이산화탄소 분압을 포화시키는 용도이기도 합니다. 완충작용에 가장 큰 역할을 하는 시약은 HEPES, sodium bicarbonate, 이 2가지 시약인데, buffer 역할을 하는 시약이라고 해서 buffering agent라고 부릅니다. 이 2 시약의 버퍼 능력을 buffering capacity라고 하죠. HEPES는 CO2 incubator가 개발되기 이전에 썼던 버퍼에이젼트이고, sodium bicarbonate는 CO2 incubator 개발 이후에 나온 에이전트 입니다. CO2 incubator는 sodium bicarbonate만 써도 괜찮긴 하지만, 조금 buffering capacity가 부족하다고 여겨지기 때문에, HEPES를 같이 넣어서 세포의 완충을 맞춰줍니다. HEPES는 버퍼능력이 강력하거든요 ㅎㅎ 혹시 더 궁금하신 점 있으시면 여기에 달아주세요 :) 댓글 감사드립니다. ㅎㅎ
네네 맞습니다 😄 동일한 세포 배양을 계속 하시다 보면, 이 정도 confluency니까 다음 배지에 이 정도 ul 넣으면 10% 정도가 되겠구나 하는게 감이 오실 겁니다. 저 같은 경우에는 CMT93라는 세포가 100mm dish에 80% 정도 자랐을 때, 펠렛 희석을 10 ml에 하고, 그 중 0.5 ml을 다음 배지에 옮겨 심으면 대충 5일 후에 subculture 하게 되더라구요. 이런 식으로 세포 서브컬쳐는 어차피 목적이 '세포를 유지'만 하면 되기 때문에, 세포 수 정도는 대충 하셔도 괜찮습니다. 영상에 나오는 세포 수 카운트가 필요한 경우는 바로 실험을 할 때 인데요. 실험을 위해서 6 well plate에 동일한 세포를 깔아야 하는 경우 셀 카운트를 꼭 해주셔야 합니다. 그리고 그것을 다음처럼 기록하셔야겠죠. "03월 17일, 100mm dish에서 80% confluency를 보인 세포를 6 well plate에 각 well당 5 x 10^5개를 seeding했더니, 2일 후 60% confluency가 되었고 실험에 사용할 상태가 되었다." 처럼요 🥰 도움이 되셨길 바랍니다. 🙋🏻♂️
@@해피콩-b8o 아 만약에 실험에 사용할 정도로 세포수가 자라면, 그 때는 세포수를 세셔도 되고 아니면 그냥 confluency만 보고 실험에 사용하셔도 됩니다. 만약에 이번에 실험을 80%에서 하셨으면, 다음에 유사한 실험도 80%일때 하시는게 좋겠죠 ㅎㅎ 저는 6 well plate에 세포를 깔때, 6 well plate의 한 개 well넓이가 대충 100mm dish의 1/4쯤 되니까, 100 mm dish 100% 찼을 때 기준으로 1/4가 되게 넣어요.(많이 넣는 편이죠) 그러면 다음 날 바로 6 well plate를 쓸수 있답니다! 적게 깔아서 자라는 시간을 오래 기다리면 실험을 그만큼 못 하게 되니까요 ㅠㅠ
90 mm dish는 10 mL, 75T flask는 15 mL이 적당합니다. 배지가 바닥 표면을 다 덮을만큼만 넣어주면 됩니다. 😄 혹시 권장량을 사용하고 싶으시면, 지금 사용하고 계신 제품이 corning사 제품인지, falcon사 제품인지, SPL 제품인지 등등 확인해보시고, 회사 홈페이지에 들어가시면 자료실에서 보실 수 있습니다!
@@ThisIsGraduateStudent 궁금한 것이 있는데 혹시 질문좀 할 수 있을까요?? 1. 12:33 에 고정댓글로 0.05ml 라고 정정하셨는데 그럼 마이크로 피펫으로 세포가 들어있는 conical tube에 50ul를 뽑아서 cell dish에 넣으면 되는거죠?? 2. 12:49 에는 세포가 들어있는 tube에 왜 2ml를 분주 하셨는지 알 수 있을까요?? 2x10^5개로 계산 해서 0.05ml는 그냥 예시로 말씀 해 주셨던 건가요?? 그리고 cell dish에 미리 분주 해 놓은 배지양은 몇 ml이고 왜 그렇게 하셨는지도 알 수 있을까요?? 13:00 10ml에 희석했으니 x10은 어떤 의미 인가요? 0.05ml넣어야 하는데 0.5ml를 넣는다 이런의미 인가요? 이렇게 해서 만약 총 10ml를 넣어야 한다면 0.5ml를 넣고 배지 9.5ml를 넣는건가요? 제가 지금 이 수업을 하고 있는데 세포수를 측정후 75ml cell flask에 배지와 더해서 넣는 양이 총 20ml 인데 왜 20ml인지 궁금해서요..
@@0208- 1. 네네, 맞습니다! 2. 0.05 ml은 예시고, 다음 날 세포를 급히 쓸일이 있을것 같아 영상에서 2 ml을 분주했던거 같습니다. ㅠㅠ Cell dish에는 대부분 10 ml을 미리 분주해두는데, 본인이 사용하는 cell culture dish 제조사 홈페이지에 가면, 배지를 얼마나 넣어야 세포가 잘 자라는지 대략적으로 계산해둔 데이터 시트가 있습니다. 100파이 디쉬의 경우에는 대부분 10~15 ml을 넣는게 세포가 잘 자라는 편이라 그렇게 넣어주었습니다. 3. 15 ml conical tube의 세포 펠렛을 1 ml에 희석해도 되지만 그 경우에는 보통 마이크로피펫을 사용해야 희석이 가능해집니다. 코니칼 튜브에 마이크로피펫을 사용하게 되면 벽면에 피펫 몸통이 닿아 컨탐 확률이 높아지기 때문에, 보통 세포 연구하시는 분들은 10 ml에 희석하고 멸균된 serological pipet을 사용하지요. 0.05 ml을 넣어야 하는데 0.5 ml을 넣는다는 말씀 정확합니다. 총 10 ml을 넣어야할 때, 원래는 9.5+0.5가 맞는 방법입니다. 하지만 일의 편리성과 속도를 위해서 저는 그냥 10+0.5로 서브컬쳐를 합니다. 75ml cell flask가 혹시 25 T flask라고 적혀있는 건가요? Dish가 부착세포를 키우는데 사용된다면 flask는 일반적으로 부유세포를 키우는데 사용하는 편입니다. (flask도 부착세포 키울 수는 있습니다!) flask에 부유세포를 키울 때에는 배지를 좀 많이 넣어주는 편인데, 20 ml을 넣어주는 이유는 아마 넉넉한 영양분을 오래 공급해주기 위해 그런 것 같습니다. 저희 연구실에서는 한 번에 20 ml을 공급해서 7일간 키우기 보다는 10 ml을 넣고 3일마다 갈아주는 방식을 채택하고 있습니다. 이 방법이 노폐물을 갈아주는데 더 효과적이긴 합니다. 😄 혹시 더 궁금한 사항이 있으시면 언제든지 질문해주셔도 좋습니다. 🥰
세포 실험은 일상 생활에 적용은 힘들어요! 🥺 하지만 배지가 액체인게 보이시죠? 우리 몸은 수분이 충분해야 세포가 제 역할을 하면서 잘 죽지 않고 회복력이 유지된 답니다. 요즘 같이 손소독제, 마스크 등으로 건조하실텐데 핸드크림, 가습기로 수분을 잘 보충하고 유지하시는건 어떨까요? 정도가 적당하겠네요 😄
네! 세포는 배지 바닥, 그리고 세포끼리 단백질로 단단히 연결되어있기 때문에, 석션으로 빨려나가지 않습니다. 물론 세포 위에서 대놓고 석션하면 빨려나가기 때문에, 영상에서처럼 구석에서 석션합니다. 또 centrifuge 이후에도 펠렛 형태로 서로 단단히 압축되어있기 때문에, 직접적으로 빨아들이지 않는이상, 석션되지는 않습니다. :)
안녕하세요. 이번에 Cell culture를 배우게 되어서 추가 학습으로 해당 동영상을 보았습니다. 덕분에 과정마다 상세하게 배울 수 있었습니다. 정말 감사합니다. 영상을 보던 중 궁금한 것이 하나 생겨서 여쭤보려 합니다. Cell counting 후에 다시 원하는 만큼 배지에 분주할 때, 1구역 당 cell이 200개 기준으로 2 x 10^6/ml가 되고, trypan blue가 2x로 들어가있기 때문에 2를 곱하여 4 x 10^6 / ml가 되는 것까지는 이해가 갔습니다. 근데 10 ml에 희석하여 x 10을 해서 넣는다는 부분에서 이해가 잘 안됩니다..ㅜㅜ 애초에 2 x 10^6/ml로 계산된 cell 수가 10 ml로 희석한 cell로 counting된 수이기 때문에 굳이 x10을 해주지 않아도 괜찮은 게 아닌가요? 밑에 동일한 질문을 댓글로 달아주셔서 친절히 설명해주신 것 읽어보았지만, 그래도 이해가 잘 안 되네요..
음 제가 계산한 방식은 뒤에 단위가 /ml로 끝나죠? 그 단위처럼 저는 10ml중 1ml만 갯수를 센 셈이에요. 하지만 저는 10ml에 세포를 희석했기 때문에, x10을 해줘야 제가 가진 희석액에 세포가 얼마나 있는지 알 수 있는거죠. 만약에 제가 저 10ml을 다시 원심분리 돌려서 이번에는 1ml로 펠렛을 부유시킨다면, 아마 1구역당 세포가 2000개가 나오겠죠. 저희는 액체에 들어있는 세포 개수가 필요한 것이지 액체 양이 중요한건 아닙니다. 항상 세포 수에만 집중하세용 ㅎㅎ 🥰 더 궁금한 사항이 있으시면 또 댓글 남겨주세요 🙇🙇
![[세포 실험] 세포 서브컬쳐 5분만에 하는 방법](http://i.ytimg.com/vi/KplM6Ys9SKg/mqdefault.jpg)
![[세포 실험] 세포 서브컬쳐 5분만에 하는 방법](/img/tr.png)
안녕하세요. 꽤 이전영상이라, 답글을 달아주실진 모르겠습니다. 영상을 보다 궁금한점이 생겼는데요. cell counting을 통해, 4x10^6 cells/ml 이라는 것을 확인했고, '2x10^5 cells' 만 계대배양을 원한다면, 10ml 희석액에서 50ul만 따서 culture dish에 넣어주면 되는것으로 생각이 되는데요.
영상에서는, "넣고 싶은 세포수에 비례하는 양을 넣어야 하고", "아까 1ml이 아니라 10ml에 희석을 했으니 x10을 해서 '넣어야 한다'" 라고 말씀해주셨는데, 이 부분들이 잘 이해가 가지 않아 질문드리게 되었습니다.
1. "넣고 싶은 세포 수에 비례하는 양을 넣어야 한다"는 말이, 예시로 들어주신 2x10^5 cells 만큼을 배양하고 싶다면 50ul을 넣으면 되지만, 더 많은 양(ex. 6x10^5)을 원한다면 50ul x 3 = 150ul을 넣어주면 된다. 이런 의미로 말씀하신건가요?
2. "아까 1ml이 아니라 10ml에 희석을 했으니 x10을 해서 '넣어야 한다'"라는 말에서는 왜 x10을 해야 하는지가 잘 이해가 가지 않습니다. 예로 들어 주신 2x10^5 cells 만큼만을 배양하고 싶다면, 계산한 그대로 10ml의 희석액에서 50ul만을 따서 넣어주면 될 것 같은데요.
여기서 x10을 해서, 50ul x 10 = 500ul을 넣어주게 되면 2x10^6 cells가 들어가게 되는 것 아닌가요?
10ml의 희석액에 들어있는 총 cell 수를 count해주기 위해서는 당연히 10배를 해주는게 맞지만,
"x10을 해서 "넣어야 한다" " 라는 말씀은, 새 culture dish에 넣어줄때, 넣어주는 양을 x10 해줘야 한다는 말처럼 들려서 질문드립니다!!
3. 그리고 영상에서는 거의 희석액 2ml를 따서 culture dish에 넣으시는 것처럼 보이는데, 해당 영상에서는 8x10^6 cells만큼이 필요하셔서 그만큼 넣으신건가요?
안녕하세요! 우선, 저도 영상을 다시 보면서 계산을 해보았는데, 카운팅을 잘못 한게 맞군요 ㅠㅠ 석사때 만든 영상이라, 군데군데 실수가 보입니다. 예리하게 잘 짚어주셔서 감사합니다. 그래도 아래에 다시 한 번 계산해보면서 차근차근 짚어보겠습니다. :)
1칸당 200개 = 200 CFU/0.1 uL
Trypan blue 희석배수 x2 = 400 CFU/0.1 uL
400 CFU/0.1 uL = 4 x 10^2 CFU/0.1 uL
= 4 x 10^3 CFU/uL
= 4 x 10^6 CFU/mL
계산에 따라 우리가 가진 세포의 농도는 4 x 10^6 CFU/mL이며, 총 세포수는 4 x 10^7 CFU입니다.
우리는 10 mL에 희석하여 카운팅 했기 때문에, 실제 총 세포수는 4 x 10^7 CFU라고 생각해야 합니다. 만약, 원심분리된 세포 펠렛을 1 mL에 suspension했으면, 4 x 10^6 CFU이라고 계산했을 겁니다. 지금 위에 보시면 제가 단위를 CFU/mL이 아닌, CFU라고만 쓰고 있는걸 보실 수 있습니다. 세포 400만개를 10 mL에 희석하든, 100 mL에 희석하든, 농도(CFU/mL)는 달라지더라도 총 세포수(CFU)는 같기 때문이죠. 우리가 최종적으로 구해야하는 것은 총 세포수이기 때문에 한번 더 10을 곱해준 것입니다.
제가 만약 전체 세포 중 2 x 10^5 CFU를 심고 싶다면, 아래와 같이 계산해야 합니다. 분모는 4 x 10^6/mL을 쓰든, 4 x 10^7/10 mL을 쓰든 상관 없습니다.
(2 x 10^5 CFU) / (4 x 10^6 CFU/mL)
CFU 소거 = [(2 x 10^5) / (4 x 10^6)] mL
= (2/40) mL
= 0.05 mL
= 50 uL
각 well당 50 uL를 seeding하면 됩니다.
1. 네, 맞습니다! 넣고 싶은 양을 부피에 비례-계산하여 넣으시면 된다는 뜻이었습니다. 잘 이해하셨어요.
2. 네 ㅠㅠ 제 실수가 맞습니다. 이 부분은 제가 댓글을 고정하여, 다른 분들이 볼 수 있도록 하겠습니다. 정확한 지적 정말로 감사드립니다.
3. 네네, 조만간 세포가 또 많이 필요했던 걸로 기억해서 1:5 정도로 seeding했습니다. 평상시에는 10 mL에 1:20 (0.5 mL) 정도로만 seeding합니다.
궁금한게 있으시다면, 언제든 댓글 남겨주세요. ㅎㅎ 좋은 하루 보내시기 바랍니다. 🥰🥰
@@ThisIsGraduateStudent 빠른 답변 정말 감사드립니다! 2x10^5cells 정도는 보통 실험 진행시 쓰이는 양이고, 단순히 culture 시에는 cell 수를 2x10^6 cells 정도가 되게 까는거군요!
@@무니-b7e 음... 이건 실험에 따라 다릅니다. 상대적으로 크기가 큰 콜로니를 얻고 싶다면 세포수를 적게 깔아서 오랫동안 키워야 하고, 크기가 작은 콜로니를 많이 얻고 싶다면 세포수를 많이 깔아서 조금만 키우는 등, 실험의 목적에 따라 세포 수는 달라집니다.
제 평균적인 실험 시딩 수는 5 x 10^4 cells/well (6 well plate 기준)이고, 다른 크기의 플레이트를 사용하면 또 그 숫자는 달라집니다. 처음에 여러 세포수를 10배수로 깔고(1x10^1, 1x10^2... 1x10^5, 1x10^6...) pilot test를 해보신 다음, 본인에게 가장 결과가 잘 나온다고 생각되는 세포수를 다음 실험부터 쓰시는게 좋습니다. 제가 말씀 드린 5x10^4도 그렇게 얻은 세포수입니다. 😊
01:15부터 나오는 화학식 설명에 빠진 점이 있어 추가해둡니다.
NaHCO3 + H2O -> Na + HCO3 + H2O
> Na + H2CO3 + OH-
> Na + H2O + OH- + CO2
(빠진 부분)
> Na + H2O + OH- + CO2 + H+
> Na + 2H2O + CO2
12:33
0.5 ml가 아니라 0.05 ml입니다!
죄송합니다. 다음부턴 좀더 신경쓰겠습니다. ㅠㅠ
대학원생들한테 한줄기의 희망같으세요....! 유익한 영상 매우 감사드립니다:)
우리 양말님들도 저의 한줄기 빛입니다...또륵 🥹 감사합니다 ㅎㅎ 좋은 주말 보내시고, 질문은 언제나 웰컴입니다 🤗
대학원 진학을 희망하고 있는 생명과학과 학생입니다. 현재 랩실에서 인턴을 하면서 실험을 배우는 중인데 찾아보다보니 여기까지 왔네요! 좋은 영상 감사합니다~~ 앞으로도 자주 올게요!
감사합니다 ㅎㅎ 제 영상이 도움이 되셨다니 정말 다행이에요. 좋은 영상 더 많이 만들겠습니다! 자주 놀러와주세요! ㅎㅎ 굳밤 되세요 💁🙇
정말 많은 도움이되었습니다 ㅠㅠㅠ 진짜 너무너무 감사합니다
감사합니다 ㅎㅎ 좋은 하루 보내세요 :)
영상에 담을 내용은 많은데, 분량은 조절하려다 보니
영상의 템포가 빠른 편입니다.
처음 보시는 분들은 0.8배속으로 이해하시면서 보시는 걸 추천드립니다.
1. 배지 confluency(세포가 차지하는 정도) 확인 - 보통 배지 표면의 80% 정도 자라면 하는 편입니다.
2. 적절한 confluency에 도달한 것이 확인되면 배지 가온.
3. 15~30분 후 재료(Conical tube, cell culture dish, pipette aid, serological pipette, Trypsin EDTA, DPBS without mg2+, ca2+, cell culture medium) 준비.
4. 기존 배지 석션.
5. DPBS 2~5 ml 분주 후 washing, 석션.
6. Trypsin-EDTA 2~3 ml 분주 후 37 'C incubator에서 30초~5분 가온.
7. 다시 꺼내와서 배지 8~7 ml(총 10ml이 되게) 분주 후 cell harvest해서 conical tube로 옮기기.
8. 1500 rpm, 3 min centrifuge.
9. pellet 빼고 석션.
10. 계산하기 편하게 적정량 배지 넣고 pellet 부유시키기.
(10-1. Cell count하기.)
11. 적절한 양의 Cell을 새 배지에 seeding하고 incubator에 넣어주기.
12. 다음 날, 배지 갈아주기.
간략히 보고 싶으면 14:53으로 🙆🏻♂️
아 너무 잘 이해가요!! 잘 보고 갑니당. 이론부분이 잘 나와서 너무 좋아요ㅜㅜ
감사합니다 ㅎㅎ 좋은 영상 많이 뽑아내볼게요 🥰
회사에서 매일 하는것과 비슷하네요 지인들 한테 무슨일하는지 설명하기 귀찮을 때 보여줘야겠어요
감사합니다 ㅎㅎ 궁금하신 점 댓글로 적어주시면 언제든지 빠르게 답변 드리겠습니다 🥰
정말 많은 도움이 되었습니다. 앞으로도 초보 실험자를 위해 영상 많이 부탁드립니다. ^^
넵 알겠습니다 감사합니다 🙇🏻🥰
지나가던 문과입니다. 우선 죄송합니다 (문과니까). 세포 수 세는 부분에서 어떤 장비를 쓰지 않고 육안으로 일일이 세는군요. 눈이 빠질 것 같은데 대단합니다 +ㅅ+
감사합니다 ㅠㅠㅋㅋ 문과 선생님들 덕분에 항상 메마른 감성을 채울 수 있죠. 저희처럼 정확한 결과가 필요한 '연구' 분야는 저렇게 세포를 하나하나 육안으로 세지만, 병원처럼 어마어마하게 많은 샘플이 있는 '진단' 분야는 세포를 기계로 셉니다.
기계보다 눈이 정확한 이유는 기계의 경우 세포가 죽고 남은 찌꺼기도 살아있는 세포라고 착각하는 경우가 많기 때문입니다. 그래서 눈으로 하나하나 보고 세는게 오히려 더 정확합니다 ㅋㅋ
그렇군요. 이렇게 또 새로운 지식의 지평을 넓혀 주셔서 감사합니다. 운 좋게 제약바이오 업계에 일하고 있는데요. 문과로서 늘 전문지식에 타는 목마름을 느끼고 있습니다. 좋은 영상 감사드립니다.
@@MagicianYoung 오 제약 바이오에 들어가셨군요. 저도 한 때 들어가고 싶었던 분야라, 얼마나 노력하셨을지 느껴집니다. 정말 고생 많으셨겠어요. 혹시라도 궁금하신 게 생기신다면 언제든 오셔서 메일이나 댓글 남겨주세요. 완벽히는 못하더라도 잘 이해될 수 있게 도움 드리겠습니다 😊
따뜻한 댓글 감사 드립니다 :) 너무나 든든한 인연이네요!
@@MagicianYoung 감사합니다 :) 🙇
안녕하세요 :) 정말 유익한 cell culture 교육 영상이네요!! 감사합니다. 구독하고 갑니다.
좋게 봐주셔서 감사합니다 :)
안녕하세요~ 너무 잘 이해 가도록 설명 해놓으셨네요:) 유익한 정보 감사합니다 🙏
감사합니다 😊🙇 좋은 주말 되세요 ㅎㅎ
안녕하세요 저는 고등학교에서 대장암 세포 LoVo를 배양하는 실험을 진행하려하는 한 학생입니다. 한국세포주 은행에서 세포주를 분양받으려하는데 Pellet Service를 통해 분양받을시 본 영상의 9:10 부터 실험 진행하면 되는것일까요?
배양 실험이 처음인지라 궁금하여 여쭈어봅니다
안녕하세요! LoVo 세포를 배양받으려 하시는군요. 하지만 배양이 목적이시라면 pellet service는 선택하시면 안됩니다! 배양이 목적이시라면 동결보존 세포를 받으시거나, 배양용 세포를 받으셔야 합니다. Pellet service는 말그대로 세포를 원심분리해서 모으고, 그 덩어리(pellet)를 제외한 상층액을 제거하여 보내주는 서비스입니다. 세포는 수분 보존이 필수적이기 때문에 pellet 형태로 오는 세포는 전부 죽은 세포라고 보셔도 무방합니다. 다시 배양을 시도해도 안 자라거나 이상하게 변질되어 자랄 가능성이 큽니다.
그러면 pellet service는 왜 하느냐, 그저 특정 세포 안에 있는 핵산이나 단백질 같은 기타 물질을 뽑아내기 위해 신청하는 서비스입니다. 이 경우, 굳이 살아있는 세포를 받을 필요는 없죠. 어차피 물질을 세포로부터 수확하려면 세포를 터트려 죽여야 하니까요. 😊
배양 가능한 세포를 받으신 다음에는 우선 동봉된 설명서에 적힌대로 따뜻한 배지(RPMI, DMEM 등)를 섞으셔서 1차로 많은 양을 불리신 다음, 대부분은 얼리고 남은 세포들을 가지고 실험 및 계대배양(영상과 같이) 하시면 됩니다. 그리고 가장 중요한 것은 LoVo cell의 현미경 사진을 찍으셔서, 인터넷에 나온 세포의 모습과 일치하는지 확인하세요. ATCC나 세포주은행이나, 내가 받은 세포가 진짜 원하는 세포인지 보장하진 않습니다. 세포은행은 그저 세포를 보관만 해줄 뿐입니다. 세포가 실제로 내가 원하는 종류가 맞는지는 꼭 외부업체에 맡기시거나 본인이 직접 확인을 거친 다음에 실험에 임하셔야 합니다. 😊
더 궁금한게 있으신가요? 언제든 질문해주셔도 좋습니다. 화이팅입니다!! 🥰
@@ThisIsGraduateStudent 그렇다면 서비스중 Fellet 이외에 DNA extraction service 가 있었는데 해당 service는 무엇인지 알수있을까요?! Fellet이 아니라면 해당 service를 선택해야 하는건지 궁금합니다😢
바쁘시면 답변 안주셔도 됩니다ㅎ
친절하신 답변 너무 감사드립니다😊
@@만숭 DNA extraction service는 LoVo 세포를 핵막까지 다 터트린 다음 DNA만 뽑아내서 보내준다는 서비스입니다. Extraction은 (특정 성분의) 추출을 의미합니다.
살아있는 세포를 받으시려면, 아마 학교에서 연구 목적으로 사용하실테니 비영리 동결(frozen) 또는 비영리 배양(culture)을 선택하셔야 할겁니다. '동결'은 얼어있는 세포스탁을 받으시는 거고, '배양'은 녹이는 과정 없이 바로 계대배양할 수 있게 플라스크에 배양되어 오는 세포를 말하는 겁니다. 😊
@@만숭 DNA extraction service는 신청하지 않으셔도 됩니다!!
감사합니다! 정말 도움 많이 되었습니다😊😊@@ThisIsGraduateStudent
너무너무 도움이 됩니다 !!!!! ❤️❤️ 감사드려요 ~!
감사합니다!! 🥰🙇🏻
작업하시는 모습을 보니 옛날 옛적 연금술사들도 이와 같았을 것 같다는 생각이 드네요 ^.^
ㅋㅋㅋㅋㅋ 그쵸 예전에 연금술사들 논문 보면 하나하나 반응시켜 보면서 일일히 관찰하던게 저희랑 비슷해 보였던 기억이 있네요 ㅎㅎ 👍
오호라. 그 시절 연금술사들의 논문이 남아 있다니 신기하네요. 감히 추측건대, 분명 그 많은 연금술사 중 유사 초전도체 합성에 성공한 이도 있지 않았을까요 (???: 뭐야 이번에도 금이 아니잖아? 버리자) ^.^ㅋ
@@MagicianYoung ㅋㅋㅋ그쵸 요즘 잠시 핫했던 초전도체도 어쩌면 발명됐을 수도 있겠네요. 그 당시 금을 개발하려 했던 연금술사들이 기록에 진심이었던 과학자들인지라, 그 덕에 재료공학, 화학이 발전했으니 어쩌면 상온상압 초전도체가 발명된다면 그들이 시초라고 볼수도 있겠네요 😆
12:55 계대배양할 때 Cell 수에 비해 Medium이 적정량보다 많으면 안 좋은 이유가 있을까요??
음 세포가 필요로 하는 배지양보다 더 많이 넣는건 상관은 없습니다. 오히려 세포에는 좋죠. 그런데 저 양에서도 자랄 수 있기 때문에 효율, 가성비 측면에서 최대한 적게 넣으려는 겁니다 ㅎㅎ
안녕하세요 저는 고1 학생입니다
제거 이번에 과학 수행평과로 세포배양 과정을 조사하고 있는데 교과서에서 산과 염기에 대해 배워서 교과서 심화로 인큐베이터에서 이산화탄소를 공급하는 이유가 ph조절에 있다는 것을 말하고 싶은데 동영상을 계속 보고 여러 자료를 찾아봐도 잘 이해가 안돼요 제가 가숙사에 살아서 질문할 사람도 없는데 참 난처합니다
혹시 co2 공급을 하는 이유와 화학식을 연결시켜 쉽게 설명해주실 수 있나요..?? 좋은 동영상 너무 너무 감사합니다 🙏
NaHCO3 + H2O ↔ (Na+) + (HCO3-) + H2O ↔ (Na+) + H2CO3 + (OH-) ↔ (Na+) + (OH-) + H2O + CO2
(NaHCO3 = sodium bicarbonate)
고등학생때 세포배양을 배운다니 되게 놀랍네요...🙊 우선 화학식은 위와 같습니다.
세포는 '배지 (Cell culture medium)'라고 하는 액체 속에서 배양을 하게 돼요. 그리고 거의 모든 세포들은 5 또는 10%의 CO2를 제공하는 37'C 인큐베이터 내에서 키웁니다.
우리가 숨쉬듯이 산소를 제공하는게 아니라 이산화탄소를 제공한다는게 이상하게 느껴질 수도 있겠지만, 5%라는 점에 잘 주의해야합니다. 왜냐하면 우리가 100% CO2를 주는게 아니기 때문에, 인큐베이터 내에도 산소가 있고 세포는 이걸 이용하기 때문이죠.
세포는 성장, 증식하면서 산 (H+) 물질을 배출합니다. 즉 똥을 싸는 거죠. 그렇기 때문에 이 산을 중화시켜주기 위해서 염기성 물질(OH-)을 만들어줘야 합니다. 이 염기성 물질을 만들어주기 위해 배지에 들어있는 물질이 sodium bicarbonate와 HEPES라는 물질입니다. 그리고 이 두 물질은 CO2가 있어야 염기성 물질을 만들어낼 수 있기 때문에 CO2를 제공해준답니다. 😊
CO2를 제공 받은 sodium bicarbonate와 HEPES라는 물질는 위의 화학식을 거쳐서 OH-를 만들게 되고, 이 OH-는 세포가 만들어낸 H+와 만나 H2O, 즉 물이 됩니다. 그래서 중성이 유지되는 거죠.🙋🏻♂️
이해가 됐나요? 혹시 더 궁금한게 있다면 언제든지 맘껏 물어봐도 좋습니다. 😄🙆🏻♂️
@@ThisIsGraduateStudent 정말이지 빠르고 깔끔한 답변 너무 감사합니다 훨씬 이해하기 쉬워졌어요
근데 아직 배움이 짧아 그런지 궁금한게 있는데요, 바보같은 질문일 수 있겠지만
저 화학식들에서는 추가적인 이산화탄소 공급을 나타내는 부분은 없지 않나요?
저 식은 첫부분에서 탄산 수소 소듐???(NaHCO3)과 물의 결합으로 식이 이루어지는 것 아닌가요? 저기에 추가적인 이산화탄소의 공급으로 염기성 물질을 형성한다라고 볼 수 있는게 뭐예요???
아니면 이산화탄소가 NaCO3와 결합해서 염기성 물질을 만드는게 아니라
CO2가 5%로 존재하는 환경에서 화학적 변화가 일어난다는 의미인가요?
@@승환위-s4y 오오 맞습니다. 사실 배지와 대기 간에 일어나는 화학적 변화에 대한 화학식이 너무 많아 여기 다 적어드릴순 없지만 ㅠㅠ 모든 조건은 CO2가 5%로 존재하는 환경 내에서만 일어납니다. 5%면 꽤 높은 이산화탄소 농도인데, 이 고농도의 포화된 대기 때문에, 배지 내에 있는 이산화탄소가 빠져나가지 못 하게 하는 역할도 있죠.
말씀 하신 내용, 전부 잘 이해하셨고 맞습니다.
감사합니다. 유용한 영상입니다!
감사합니다! 😄
세포배양이라는것이 세포를 외부의 환경에서 증식시키고 유지시키는 일로 알고있는데 혹시 위 영상에서 배양과정이 나오나요? 진짜 잘 몰라서 그러는데 위 영상은 세포를 dish에 옮겨 enubauer chamber에 넣고 수를 세는 실험같아서요...보고서 작성에 참고하려고 하는데 자세한 답변 부탁드립니다 ㅠ
아 위 영상은 세포 배양 중에 계대배양(서브컬쳐 subculture) 과정을 말하는 영상이에요. 세포 배양에 있어서 거의 필수적인 과정으로, 찬영님께서 말씀하시는 세포를 유지하는 과정의 끝이자 시작이라고 말씀 드릴 수 잇어요.
배양을 할 때는 따로 뭔가 해줄 필요 없이 그냥 CO2 incubator에 세포가 있는 dish를 넣고 기다리기만 하면 됩니다. 그래서 서브컬쳐 하는 영상만 올린 것이지요. 😁
@@ThisIsGraduateStudent 감사합니다!!!! 궁금증 완전 해결되었습니다!!
@@눈코눈-i3b 넵 ㅎㅎ 감사합니다 🥰🥳
안녕하세요 세포배양에 대해 조사를 하던 한 고등학생입니다 글로만 되어있는 자료에선 세포 배양에서 잘 모르겠는 부분이 많았는데 이렇게 동영상으로 보니 덕분에 이해가 잘 갔습니다 저희 고등학교에서 직접 실험을 해보고 싶었는데 아무래도 한계가 있어 주변에 있는 대학 연구소에 도움을 받고자 하는데 혹시 저같은 일반고 학생도 연구소에서 도움을 받을 수 있을까요? 그리고 만약 허락을 해주신다면 고가의 장비를 뺀 나머지는 저희가 다 준비해서 가야하는 건가요 아님 안그래도 되는건가요? 이런 경험이 처음이라 이런 기초적인 질문을 드리게 된 점 정말 죄송합니다
안녕하세요, 조수빈 님. 아마 고등학교에서 이러한 도움을 대학 연구실에 얻고자 하실 경우, 과학 담당 선생님께서 연구실 담당 교수님과 따로 연락을 하여 일정 조율을 하는 것이 일반적인 관례입니다. 저같은 대학원생도 어떻게 보면 제 개인용품이 아니라, 교수님 연구실에 소속되어 물품을 '빌려' 사용하는 것이기 때문이죠. 그래서 예의상 선생님과 교수님 간에 연락을 하심이 옳은 것 같습니다.
장비 대여 같은 경우는 교수님 성향상 허락해주실 수도 있고, 아닐 수도 있는데, 이건 교수님 성격에 달려있는 거라 참 말씀 드리기 어렵네요. 제 연구실이라면 얼마든지 빌려드리고 싶지만, 저희 연구실은 조금 힘들듯 합니다 ㅠㅠㅠ 죄송하네요.
고가의 장비를 제외한 나머지 품목들 또한 준비를 해오시기에는 조금 어렵지 않으실까 싶습니다. 장비 보다는 저가라고 해도, 다들 가격이 개당 5000원이 넘는 고가이기 때문이죠. 물품을 들고 온다기 보다는,
저희는 ㅇㅇ같은 연구 및 실험을 해보고자 합니다. 이러한 연구를 하기 위해서는 ㅇㅇ한 실험을 해야할 것 같은데, ㅇㅇ한 실험에는 이러이러한 재료가 필요합니다. ㅇㅇ한 재료 중 일부는 저희가 갖고 있으니, 나머지 장비에 대해 대여하고자 합니다.
이런 식으로 구체적인 실험 계획을 구상해 가는 것이 보기에도 설득하기에도 더 좋겠죠?? 😊
저도 이런 기초적인 질문에서 성장을 하고 여기까지 올라온 과학자입니다. 전혀 죄송하지 않으셔도 돼요. 모르거나 생소한 것은 죄가 아닙니다. 알려고 용기내어 노력한다는 건 대단한 거죠. 앞으로의 실험에 좋은 결과가 있길 바랍니다 ㅎㅎ
혹시 세포 배양에 궁금한 점이 있으시면 redberry1245@naver.com으로 메일 한번 주세요. 도움될 수 있으면 자세히 알려드리겠습니다. 🙆🙋
@@ThisIsGraduateStudent 답변해주셔서 감사합니다! 덕분에 더욱 꼼꼼한 준비를 할 수 있을 것 같네요 궁금한 점이 생기면 메일로 찾아뵙겠습니다ㅎㅎ 감사합니다!!
실험 경력이 없는데 실험을 하게된 ㅠ.ㅠ 비운의 1인입니다. 셀카운팅이 막혀서 조언을 구해보고자 질문을 합니다. 죄송합니다.
-100파이에서 키워진 셀을 25T 플라스크에 옮겨 담아야 하며 25T 플라스크는 5ml의 메디아가 있고 그 곳에 1*10^6 씩 셀을 넣어야 함.
- 트립신 10 ul : 세포 10 ul
- 메디아 1ml 로 셀커운팅 진행시 258 나옴 ( 헤모~ 4군대 세어준 상태 )
-129 x 10^4 : 1000 = 1*10^6 : x
x = ( 1000 * 1*10^6 ) / 129 x 10^4
x = 775
-t25플라스크에 메디아 5ml 뿌린 곳에 셀을 775ul 을 넣으면 1*10^6 으로 넣게 된건가요?
- 셀카운팅하고 나온 수를 메디아 5ml 뿌린 곳에 1*10^6 식으로 넣어야 하는데 여기서 부터 어떻게 계산하는지 막혀서요 ㅠ
여기 동영상보며 열심히 실습하고 있습니다
항상.감사합니다
일단 먼저 감사하다는 말씀 드립니다 ㅎㅎ 🥰
hemocytometer에서 4군데를 센 결과 258이 나왔다면, 258/0.4 ul라고 볼 수 있습니다. 1칸이 0.1 ul를 의미하거든요!
우선 258÷4를 하셔서 1칸의 평균수를 구합니다.
258÷4=64.5 --> 64.5/0.1 ul
trypan blue에 1:1 희석된 거기 때문에 2배를 해줍니다.
64.5/0.1 ul --> 129/0.1 ul
1 ml에 희석하셨기 때문에 x10^4을 해줍니다.
129 x 10^4/ml --> 1.29 x 10^6/ml
넣어야 하는 세포 수를 가지고 있는 세포 수로 나누면~
(1.0x10^6)/(1.29×10^6) = 1/1.29 = 0.7751...
셀을 1 ml로 섞으신 곳에서 775 ul를 25T 플라스크로 넣으시면 1x10^6을 넣으신게 맞습니다!
검산을 해보니 댓글에 작성해주신 계산 과정이 정확합니다.
계산 하실 때 플라스크에 이미 넣으신 5 ml은 신경을 쓰지 않으셔도 됩니다. 5 ml을 넣었든 500 ml을 넣었든, 세포의 수는 변하지 않으니까요. 세포를 몇 ml에 희석해서 계산하셨는지 그것만 신경쓰시면 됩니다. 계산 너무 잘 하셨습니다.
그리고 25T 플라스크에 5 ml은 조금 적다는 생각이 듭니다. 권장량은 15 ml이고, 저희 연구실에서는 10 ml 이상을 넣어주고 있습니다. 짧게 키울 예정이시면 상관 없지만 플라스크 제조사 홈페이지로 가셔서 적정 배지 용량을 살펴보시는게 좋을 듯 합니다.
저도 아무 관련 지식이 없는 상태에서 실험을 시작했던 사람입니다. 공부하시다 보면 금방 쑥쑥 느실거에요. 실험의 스킬보다는 이 실험을 왜하는지, 논리 및 가설에 초점을 맞춰서 하시다 보면 정확한 실험을 하실 수 있을 거에요! 잡담이 길어졌네요 ㅎㅎ 좋은 하루 되세요 🙆♂️🙇🙋♂️
답변 감사합니다. ㅠ 셀카운팅 문의가 더 있는데요.
1. 셀을 계산했을때 변환한 값이
예를 들어 제가 뿌려야 하는 양이 1 *10^6인데 ,
3 × 10^4 라던가 6 * 10^7 이라던가 했을때도 넣어야 하는 세포수에서 가지고 있는 세포수를 나누면 되는거죠?
2. 여러개의 티플라스크에 뿌리고 싶은경우에는 기존에 디시를 여러개 만드는 수 밖에 없겠죠?
바쁘실텐데도 소중한 답변 달어주셔서 감사합니다!
@@dream3345 1. 네 맞습니다! 분모와 분자는 변하지 않아요 ㅎㅎ
2. 저는 그래서 세포를 계대배양할 때 커다란 곳에 많이 키웁니다. 얼마가 필요할지 모르니 150파이 디쉬, 75T 플라스크를 여러개로 넉넉하게 키워놓죠. 그리고 세포를 처음에 심는 양을 다르게 해서 매일 완성된 디쉬가 나오게 해놓아요.
예를 들어서 1개 심은 디쉬, 2개 심은 디쉬, 4개 심은 디쉬, 8개 심은 디쉬. 이런식으로 디쉬를 만들면 세포가 자라면서 2배수로 늘어나니까 매일 꽉찬 디쉬를 8개, 4개, 2개, 1개 심었던 순으로 나오게 되죠. 헤헤
실험 처음 하시는데도 질문 수준이 꽤 높으셔서 깜짝 놀랐습니다. 항상 화이팅입니다 💜🙇🙋♂️
@@ThisIsGraduateStudent 답변 감사합니다!
기존에 새로 만드는 디시에 메디아가 미리 뿌려져 있다는 부분에 꼿혀서 진짜 많이 헷갈렸는데 헷갈림이 확 가셨어요!
100파이 디쉬에 셀을 좀 많이 뿌려서 나중에 디시 하나로도 25t 플라스크 여러개 만들수 있도록 하려구요!
답변 감사합니다. 항상 좋은 정보 감사합니다!
@@dream3345 넵ㅎㅎ 감사합니다 🥳🙆♂️🙇
안녕하세요 실험에 전혀 지식이 없는 상태에서 의대에 입학하게 되었는데, 덕분에 정말 큰 배움을 얻었습니다!
이런 영상 올려주셔서 너무 감사드립니다 ㅠ
저도 입학 당시 비슷한 상황이었어서 이해가 더 잘 되네요. ㅠㅠ 자주 올리겠습니다. 화이팅 🙆🏻♂️
잘보고배워갑니당!!!
감사합니다 굳밤 되세요 ㅎㅎ 🙋♂️
계산 매번 헷갈리는 드리미 입니다.
migration / invasion assay 실험을 하게 되었는데요. 프로토콜만 받고 하는데 암튼 미치고 있는 중입니다. ㅠ
upper chamber 뿌리는 양이 헷갈려 문의 드립니다. 왜 자꾸 계산이 헷갈리는지. 흑흑 ㅠ_ㅠ
프로토콜에 보면 upper chamber에는 1×10^4 , 2×10^4, 3×10^4 으로 씨딩을
하되 200ul씩 넣어라 라고 되어 있더라구요.
upper chamber에 뿌리기 전 1ml로 셀을 희석 후 카운팅을 하니 6.45×10^5 이렇게 나왔습니다.
그래서 저는 200ul 이니 1ml(1000ul)의 5분의 1이니까 나온 값의 5분의 1로 나눠봤는데요
645000 (1ml) ==> 129000 (200ul)
그리고 이 상태에서 1×10^4 , 2×10^4, 3×10^4 나눠야 하니 비례식으로 해서 아래와 같이 계산했거든요.
200ul로 나온 값 / 뿌리고자 하는 값
129000 / 10000 ( 1×10^4 )
1×10^4 ==> 12.9ul upper chamber 씨딩 나머지는 SFM 넣어 200ul 만듦
129000 / 10000 ( 1×10^4 )
2×10^4 ==> 6.45ul upper chamber 씨딩 나머지는 SFM 넣어 200ul 만듦
129000 / 10000 ( 2×10^4 )
2×10^4 ==> 4.3ul upper chamber 씨딩 나머지는 SFM 넣어 200ul 만듦
129000 / 10000 ( 3×10^4 )
저런 식으로 계산해서 upper chamber에 넣었는데 이게 점점 제 자신에 대한 의심이 들어서요 ㅠㅠ
잘 넣은 건가..삽질한건가.. 싶어서요 ㅠㅠ
1000 ul를 200 ul로 바꿔서 하신 부분은 조금 오류가 있는 듯 하여, 제가 하는 방식을 알려드리자면,
저는 아마 멸균된 EP tube 3개를 준비한 다음, 1 ml에서 제가 가져올 세포양을 먼저 계산했을 겁니다. 1x10^4 그룹을 예로 들자면,
6.45x10^5개의 세포에서 1x10^4을 채취하려면,
1x10^4 / 6.45x10^5 (ml)
= 1 / 6.45 x 10
= 1/ 64.5
= 0.0155...(ml)
= 15.5 ul
제가 6.45x10^5개의 세포가 있는 1 ml에서 1x10^4개의 세포를 취할려면, 1 ml에서 15.5 ul를 파이펫으로 뜨면 된다는 뜻입니다. 15.5 ul 안에 1x10^4이 있다는 얘기죠.
그리고 아까 준비해 둔 EP tube에 serum medium 184.5 ul를 넣고, cell 15.5 ul를 넣어서 잘 섞어줄겁니다. 이렇게 합쳐진 200 ul를 upper chamber에 분주하겠죠. 나머지도 똑같이 계산에서 200 ul로 맞춰준 다음 넣을 겁니다.
혹시 upper chamber에 serum medium이 아닌 serum free medium을 넣으시는 건 어떤 시약을 추가해서 넣으시려는 의도이신 건가요? Serum free medium을 migration assay에서는 잘 사용을 안 해봐서요 🤔
암튼 한 번 읽어보시고 또 궁금한거 있으시면 댓글 달아주세요 😊🙇
@@ThisIsGraduateStudent 어메 이제사 저거 뿌리는거 이해가 확 갔어요!
그리고 저 셀 씨딩 다 잘못했네요. 허허허허
저는 ep tube에 안놓고 업퍼챔버에 그냥 뿌렸는데 선생님 방식으로 그렇게 해야겠어요!
프로토콜 받은거에는 아무것도 넣지 않은 일반 rpmi1640 넣으라 해서 업퍼챔버에 뿌릴때 그렇게 만들었었어요!
소중한 답변 감사합니다 :)
@@dream3345 아 RPMI로 하시는구나! 그러면 serum free가 이해되네요. ㅋㅋㅋ세포 실험 대박나세요! 아 물론 세포는 EP tube뿐만 아니라 5ml screw tube나 15 ml conical tube 쓰셔도 문제없습니당!
오... 후드를 이렇게 높이 열어도 괜찮은거였나요? 예전에 할때 무서워서 팔만 들어갈정도 높이로 했었는데... 실험결과 잘나오시길 바라요! :-)
감사합니다 😄 저 후드는 저 정도가 적정 높이더라구요 ㅎㅎ 다행히 몇년간 컨탐은 안 일어났습니다. 송송송님도 실험 화이팅입니다. 🙋🏻♂️🥰
너무 자세하게 볼수있어서 많은 도움이 되었습니다.
하나 궁금한게 유산균 배양시에도 위에 보여주신것과 같이 계대배양 진행하나요?
배지나 용액은 다르겠지만 유산균배양은 어떻게 하는지 궁금해서 여쭤봅니다!
유산균도 비슷합니다! 하지만 세균은 액체배지만 사용하는 세포와 다르게 고체 배지도 사용하죠.
세균을 키울땐, 먼저 고체 배지에 키워서 내가 원하는 균이 맞는지 다른 균이 오염되진 않았는지 먼저 선별과정을 거칩니다. 여기서 내가 원하는 세균을 다시 한 번 고체 배지에 펴 발라서 양을 엄청 늘린 다음, 액체 배지로 옮겨줍니다. 본격적인 증균은 부피를 많이 늘릴 수 있는 액체배지에서 실시하고, 계대배양은 액체배지로 하는 것이 좋습니다.
유산균의 경우 자라는 속도가 빠르기 때문에, 조금 쉬고 싶다면 고체배지를 파라필름이라는 실링테이프로 밀봉하고 냉장 보관하는 것도 방법입니다. 냉장 보관만 잘 된다면, 한달 후에 계대배양을 이어서 해도 문제 없습니다.
세포수를 새어봤는데 세포가 360만개(5ml) 있다고 한다면 각 well에 20만개씩 분주하려고한다면 어떻게 계산공식을 해야할까요? 맨날 헷갈립니다.(그냥 나누면 되는것 같은데..) ㅠㅠ 저 영상에 나아있는 계산대로 하면 0.5ml이 아니라 0.05라고 나오거든요.. 저는 ㅠㅠ 단위가 안맞아서 그런건가요?..하 ㅠㅠ 셀카운팅기계 샀으면 하는데 ㅠㅠ
안녕하세요 ㅎㅎ 우선 영상 시청해주시고 이렇게 댓글도 달아주셔서 감사합니다.
5.0 ml에 세포가 360만개 있다고 하셨는데, 앞으로 세포 갯수를 적으실 때 3.6 x 10^6으로 적는 습관을 들이시는 게 좋을 듯 합니다. 논문에 기입할 때도 어차피 저렇게 적어야 하고, 0의 개수를 정확히 적을 수 있기 때문에 실수할 확률도 줄기 때문이에요!
자, 다시 돌아와서 3.6 x 10^6 cell이 5 ml에 있다고 하면, 계산은 다음과 같습니다.
(내가 넣고 싶은 세포수) ÷ (내가 가진 세포수) = (넣어야하는 ml양) 의 공식을 쓰면 됩니다.
20만 ÷ 360만
= (2.0 x 10^5) ÷ (3.6 x 10^6)
= 2 ÷ 36
= 1 ÷ 18
= 0.055...ml
= 2.0 x 10^5 cells/0.055...ml
하지만 이 계산법에는 한가지 놓치기 쉬운 점이 있어요. 🤔 바로 0.055 cells/ml의 ml이에요. 이 공식은 선생님이 가지고 계신 360만개의 세포가 1 ml의 배지에 들어있다고 가정하고 계산된 것이에요. 그래서 같은 360만개의 세포가 1 ml이 아닌 5 ml에 들어있다는 것은, 5배 희석됐다는 의미와 같습니다. 그래서 0.055...x 5 ml의 양을 옮겨야 그 안에 20만개의 세포가 들어있게 되죠. 🙊
0.055... x 5
= 0.277...
= 0.278 ml (278 ul)
= 2.0 x 10^5 cells/278 ul (pipette loss 생각한다면 16 wells에 seeding이 가능하겠군요!)
제가 이런 복잡한 계산을 하기 싫어서 1 ml에 세포를 희석하자니 양이 너무 적어서 위험하고, 계산하기 편하려고 10 ml에 희석하자니 너무 세포가 희석되는 것 같고...😥 이러한 문제를 해결하기 위해서 만든 방법이 요 영상에 있습니다. --> ruclips.net/video/6YkYmR7QFZs/видео.html
+ 추가적으로 셀카운팅 기계는 병원, 연구소 등에서 다량의 세포 검체를 세야할 때 쓰는 것이지, 트리판 블루로 염색해서 손으로 카운팅하는 것이 가장 정확합니다! 실제로 세포를 카운팅해서 비교해보면, 기계보다 현미경 보면서 하는게 훨씬 정확합니다. 게다가 셀카운팅 기계는 주기적으로 Q.C.와 정비가 필요하기도 하구요. 기계는 너무 많은 양을 도저히 소화하기 힘들 때 사용하는 장비라는 점! 너무 맹신하지는 마세요. 🥰
++ 영상 더보기 란에 제 인스타 아이디와 이메일이 있으니 궁금하신 점은 언제든지 이용해서 물어봐주세요! 최대한 제가 아는 선에서 도움드리겠습니다. 오늘도 행복한 하루, 맛있는 저녁 되세요 ㅎㅎ 🙋♂️
@@ThisIsGraduateStudent 자세한 설명 너무나도 감사합니다! 이해가 잘 되었습니다!! 앞으로도 유익한 영상 많이 기대하겠습니다!
@@짜아앙구-k1e 감사합니다 🥰🙇🙇
많은 도움이 되는 영상이었습니다! 하나 의문점이 있어서 질문을 드립니다 ㅜㅜ 트립신 처리 후에 배양을 끝낸 페트리 접시를 보면 그 안에 든 용액의 색깔이 배양기에 들어가기 전보다 주황빛을 띠고 있는데 이건 왜 이런 건가요? ㅜㅜ
7:03 분경에서요!
흠 이 문제에 대해서 깊게 생각해 본 적이 없네요 ㅋㅋㅋ 아마 2가지 이유라고 생각 되는데, 하나는 세포가 떨어져 나와 하얗게 뭉쳐 보여서 색이 변했거나, Trypsin에 같이 든 EDTA로 인한 pH 변화 때문에 그럴 겁니다.
학교에서 3차원 세포배양 실험을 진행하려고 하는데 실험방법을 어디에서도 찾을수가 없어서 질문들리려고 합니다ㅠ 혹시 이 영상에 나오는 세포배양 실험이 3차원 세포배양 실험인가요?
아닙니다 이거는 부착성세포 중에서도 단층세포라서 ㅠㅠ 다음에 기회가 되면 올려보긴 할텐데 많이 부족할겁니다 ㅠㅠ
@@ThisIsGraduateStudent 한번 꼭 올려주시면 감사하겠습니다...^^;;
넵 ㅠㅠ 전공이 아니라 많이 공부하고 올려보겠습니다 ㅠㅠ 그때까지 화이팅 🥰🙋🏻♂️
감사합니다
감사합니다 ㅎㅎ 좋은밤 보내세요 🙇
안녕하세요! 세포배양을 막 시작한 실험 초보자입니다! 영상을 보고 많은 도움을 받고있어요 ㅎㅎㅎ 그런데 혹시 media change를 배양 5일차 정도에 해주었을때 cell에 영향이 있을까요? 실험일정 조율이 불가할 경우가 있어서 혹시 세포에 문제가 생길까 걱정되서요..ㅠㅠ
media change를 할때는 규칙을 세워두시면 좋을듯 합니다.
- 세포를 seeding한 다음 날 해준다
: Subculture에 의한 스트레스로 죽은 세포를 없애는 목적입니다
- Subculture 후 3일마다 media change해준다.
: 보통 3일마다 배지 안에 있는 FBS 같은 영양분들이 세포들에 의해 고갈되기 때문에, 3일마다 해주는 것이 좋습니다. 세포를 구매하실때 받은 data sheet에 보면 몇일마다 배지를 갈아주는게 좋은지 나와있습니다.
- 실험 전날에는 배지를 갈아주지 않는걸 권장드립니다.
: Media change 후에는 일부 세포가 유실되기도 하며, 세포의 모양이 살짝 round해지는 등, 짧은 시간임에도 약간의 변화는 생길 수 있습니다.
어차피 media change의 목적이 죽은 세포를 제거해주고, 고갈된 영양분을 새로 채워주는 목적이니, 실험 12시간 전에 죽은세포가 별로 없거나, 배지가 노랗게 변하지 않았다면 굳이 media change를 해줄 필요는 없습니다. :)
실험일정 조율을 위해 세포에 미디어 체인지를 해주실 필요는 없습니다. 만약 조율이 불가하시다면 그냥 과감히 세포를 버리시고 새로 키우는 걸 추천드립니다. 왜냐하면 세포를 더 놔뒀다가 실험하거나, 급해서 일찍 해버리면, 본인이 원하는 세포 수보다 많거나 적은 상태에서 실험이 시작될수도 있기 때문이죠. 실험 12시간 전만 아니라면, 미디어 체인지 자체가 실험에 영향을 미칠만큼 세포에 큰 문제를 주진 않습니다. ㅎㅎ
궁금하신 점이 있으시면 언제든 댓글 또는 메일 주세요 😊
근데 궁금한게 있는데 배지 안에 들어있는 sodium carbonate가 배지의 물과 만나게 되면 HO-를 생성하는데 이는 세포에서 나오는 산성 H+와 만나 H20 물이 되기 때문에 산성화를 막을 수 있다. 고 하셨는데 이게 co2 를 넣어주는거랑 무슨 상관이 있는 걸까요? ㅜㅜ
sodium bicarbonate는 CO2 incubator가 발명되고 난 이후에 개발된 물질이고, 이전에 CO2 없이 세포를 키웟을때는 pH를 조절해주기 위해 HEPES라는 물질을 사용했었어요. 물론 sodium bicarbonate는 우리 몸에 있는 물질이라 세포에 데미지가 덜 하지만, 아무래도 완충 능력(buffering capacity)이 떨어지다 보니 HEPES를 같이 넣어 키워준답니다.
CO2를 넣어주는 이유는 체내 혈액에도 저농도의 CO2가 섞여있기 때문인데요. (0.05%인지 좀 헛갈리네요.) 세포의 pH가 떨어지게 되면 sodium bicarbonate, HEPES 같은 친구들이 pH를 올려주는데, 여기서 CO2는 다음과 같은 역할을 하게 됩니다.
CO2 유입 → CO2 + H2O → H2CO3 → 이 중 70%가 HCO3-, 즉 bicarbonate가 됩니다.
추가적으로 혈중은 저농도의 CO2가 있는데 왜 incubator는 5%라는 고농도의 CO2를 공급해주냐면, 바로 우리 몸은 스스로 대사를 조절할 수 있는 open system, 몸 밖의 세포는 외부환경에 대해 스스로 물질을 조절할 수 없는 close system이기 때문입니다. 그래서 조금 더 과잉으로 고농도를 넣어 안전하게 공급하고자 하는 것이죠.
찡끗ㅡ★
@@ThisIsGraduateStudent 헝헝 멋지신분 ㅜㅜ 새벽에 궁금했어여 적게 일하시고 많이 버세여 찡긋
@@해피콩-b8o 감사합니다 ㅎㅎ 해피콩님도 행보칸 주말 되세요 홍홍홍🥰
좋은 영상 감사합니다 ! 궁금한 점이 있는데 CO2를 공급함으로서 pH를 올려준다고 했는데 왜 페놀레드 색을 통해 염기성이라면 버퍼 또는 CO2부족인걸까요??
우선 댓글 달아주신 점 감사드립니다. 😆🥰
NaHCO3 + H2O ↔ (Na+) + (HCO3-) + H2O ↔ (Na+) + H2CO3 + (OH-) ↔ (Na+) + (OH-) + H2O + CO2
CO2가 5% 이하로 낮아지면, 위의 식에 따라서 OH-가 증가하게 되고, 따라서 pH는 증가하게 됩니다.
5%의 고분압 CO2는 세포에 CO2를 공급하는 목적도 있지만, 배지 속 CO2가 기화되지 못 하게, 인큐베이터 내 이산화탄소 분압을 포화시키는 용도이기도 합니다.
감사합니다 !!! 혹시 세포 배양시 중성 환경으로 pH가 조절되는것이 좋나요?!
@@pcl1004104 그건 세포를 구매하신 곳에서 주는 data sheet를 확인하거나 기존에 키우시던 분을 통해 확인하는게 좋아요!
간혹 약산성에서 키워야하는 세포도 있고, 일부 곤충 세포주는 pH 6.2에서 키워야하기도 하거든요 🙆🏻♂️🙆🏻♂️
제가 궁금한 점이 있는데 영상에 (2x10^5) / (4x10^6) 하면 0.05ml가 되어야 되는게 아닌가요??
그리고 혹시 세포랑 염색약이랑 섞어서 넣어준 10마이크로 미터는 계산에 영향을 주지 않는건가요??
0.05ml 가 맞네요 ㅠㅠ 제가 계산을 잘못 했네요.
세포랑 염색약이랑 1:1로 섞어주었기 때문에 최종적으로 희석배수 x2를 해줍니다!
답변 감사합니다! 공부하는데 영상이 많은 도움 되고 있네요 ㅎㅎ 앞으로도 좋은 영상 많이 올려주세요!
@@김동한-w8l 넵 ㅎㅎㅎ 좋은 영상으로 보답하겠습니다 감사합니다 🙇🏻🙆🏻♂️
안녕하세요! 질문이 있는데 cell culture 와 sub culture의 차이가 무엇인가요??
네, 안녕하세요! 답변드리겠습니다 😄
Cell culture라는 세포 배양 기술에는 크게 2가지 종류가 있습니다. Primary cell culture, Subculture가 대표적인 세포 배양인데요!
Primary는 초대, 첫번째의, 원시적인, 이런 뜻을 가지고 있으며, 생명체의 몸에서 세포를 떼어내 처음으로 몸 밖의 세포배양접시 등에 옮기는 행위를 말합니다. 떼어낸 세포는 백혈구, 골수세포, 줄기세포 등과 같은 일반 정상세포가 될 수도 있고, 상피종, 육종 세포와 같은 암세포가 될 수도 있습니다. (물론 primary tissue culture라고 해서 조직을 심는 방법도 있어요!)
Subculture를 설명드리면, sub의 뜻은 다음의, 아래의, 과정의 다음 단계 등과 같은 뜻을 가지고 있습니다. 아까 떼어낸 세포가 정상세포일수도, 암세포일수도 있다고 말씀드렸는데, 암세포를 굳이 떼어내서 사용하는 이유는, 물론 암을 연구하기 위한 것도 있지만 암세포 자체가 불멸의 세포이기 때문입니다. 암세포의 정의가 분열을 멈추지 않고 비정상적으로 끊임없이 분열하는 세포이니, 조건만 잘 맞춰준다면 죽지 않고 계속 배양을 이어나갈 수 있죠. (제가 키우는 암세포도 30년 넘게 살아있는 친구입니다.) 이에 반해 정상 세포는 줄기세포의 경우라 해도 분열을 5번 이내 밖에 못하고 금방 죽어버리고 맙니다. 그래서 매번 실험을 할때마다 쥐, 토끼 같은 생물을 죽여서 세포를 꺼내줘야 하죠.
정상세포의 경우 별로 서브컬쳐할 일이 없다고 치고 암세포의 경우로 subculture를 하는 이유를 말씀드리겠습니다. 암세포를 배양용 접시(cell culture dish)에 키우다 보면, 분열을 계속해서 언젠가는 접시를 꽉 채울만큼 수가 많아지게 됩니다. 세포는 본인이 자랄 공간이 더 이상 없게 되면 자살을 하기 시작하는데, 이로 인해 어느 정도 수가 자라면 그 중의 일부만 새 배양용 접시로 옮겨서 자랄 공간을 확보해줘야 합니다. 이렇게 기존의 꽉 찬 배양용 접시에서 새 배양용 접시로 옮겨주는 행위를 subculture라고 부릅니다. subculture하지 않고 세포를 방치할 경우, 결국에는 모든 세포가 비좁은 공간에서 다 죽고 맙니다.(좀 함축해서 얘기하자면 세포들끼리 여기 환경이 더 자라기에 여의치 않으니 서로 자살하자는 신호를 주고 받는 겁니다.)
요약하자면,
Cell culture (세포 배양)
1) Primary cell culture = 세포를 처음으로 체외로 이식하는 행위.
2) Subculture = 세포를 유지시키기 위해 새로운 배양접시로 옮겨주는 행위.
Primary cell culture --> subculture #1 --> subculture #2 --> subculture #3 ... --> subculture #n...
@@ThisIsGraduateStudent 오!!! 답변 너무 감사합니다!!
세포배양 과정 속 완충작용의 실험식과 설명 조금만 부탁드려도 될까요
이전에 물어보신 분이 계셔서 달았던 답글을 가져왔습니다! :)
NaHCO3 + H2O ↔ (Na+) + (HCO3-) + H2O ↔ (Na+) + H2CO3 + (OH-) ↔ (Na+) + (OH-) + H2O + CO2
CO2가 5% 이하로 낮아지면, 위의 식에 따라서 OH-가 증가하게 되고, 따라서 pH는 증가하게 됩니다.
5%의 고분압 CO2는 세포에 CO2를 공급하는 목적도 있지만, 배지 속 CO2가 기화되지 못 하게, 인큐베이터 내 이산화탄소 분압을 포화시키는 용도이기도 합니다.
완충작용에 가장 큰 역할을 하는 시약은 HEPES, sodium bicarbonate, 이 2가지 시약인데, buffer 역할을 하는 시약이라고 해서 buffering agent라고 부릅니다. 이 2 시약의 버퍼 능력을 buffering capacity라고 하죠.
HEPES는 CO2 incubator가 개발되기 이전에 썼던 버퍼에이젼트이고, sodium bicarbonate는 CO2 incubator 개발 이후에 나온 에이전트 입니다. CO2 incubator는 sodium bicarbonate만 써도 괜찮긴 하지만, 조금 buffering capacity가 부족하다고 여겨지기 때문에, HEPES를 같이 넣어서 세포의 완충을 맞춰줍니다. HEPES는 버퍼능력이 강력하거든요 ㅎㅎ
혹시 더 궁금하신 점 있으시면 여기에 달아주세요 :) 댓글 감사드립니다. ㅎㅎ
ㅎ ㅏ 역시 계산하는게 제일 어려워 수포자..
그쵸...저도 참 어렵답니다... 혹시 계산이 잘 안풀리시거나 검토를 원하시면 댓글에 언제든 남겨주세요 ☺️
저 계대배양 할때 마다 세포 수를 세주지 않고 미리 계산한대로 해도 된다 하셨는데 그게 무슨 뜻일까요ㅜ 1주일만에 이만큼 자랐겠다~하고 예상하는건가요??
네네 맞습니다 😄
동일한 세포 배양을 계속 하시다 보면, 이 정도 confluency니까 다음 배지에 이 정도 ul 넣으면 10% 정도가 되겠구나 하는게 감이 오실 겁니다.
저 같은 경우에는 CMT93라는 세포가 100mm dish에 80% 정도 자랐을 때, 펠렛 희석을 10 ml에 하고, 그 중 0.5 ml을 다음 배지에 옮겨 심으면 대충 5일 후에 subculture 하게 되더라구요.
이런 식으로 세포 서브컬쳐는 어차피 목적이 '세포를 유지'만 하면 되기 때문에, 세포 수 정도는 대충 하셔도 괜찮습니다.
영상에 나오는 세포 수 카운트가 필요한 경우는 바로 실험을 할 때 인데요. 실험을 위해서 6 well plate에 동일한 세포를 깔아야 하는 경우 셀 카운트를 꼭 해주셔야 합니다. 그리고 그것을 다음처럼 기록하셔야겠죠.
"03월 17일, 100mm dish에서 80% confluency를 보인 세포를 6 well plate에 각 well당 5 x 10^5개를 seeding했더니, 2일 후 60% confluency가 되었고 실험에 사용할 상태가 되었다."
처럼요 🥰
도움이 되셨길 바랍니다. 🙋🏻♂️
@@ThisIsGraduateStudent 아 그럼 6 well plate에 옮기고 세포가 증가해 (6well에 윪길때 적은 수를 일부러 옮기나요?) 실험에 쓸 상태가 되면 또 세포 수 세서 실험에 사용하면 되는거죠?
@@해피콩-b8o 아 만약에 실험에 사용할 정도로 세포수가 자라면, 그 때는 세포수를 세셔도 되고 아니면 그냥 confluency만 보고 실험에 사용하셔도 됩니다.
만약에 이번에 실험을 80%에서 하셨으면, 다음에 유사한 실험도 80%일때 하시는게 좋겠죠 ㅎㅎ
저는 6 well plate에 세포를 깔때, 6 well plate의 한 개 well넓이가 대충 100mm dish의 1/4쯤 되니까, 100 mm dish 100% 찼을 때 기준으로 1/4가 되게 넣어요.(많이 넣는 편이죠)
그러면 다음 날 바로 6 well plate를 쓸수 있답니다! 적게 깔아서 자라는 시간을 오래 기다리면 실험을 그만큼 못 하게 되니까요 ㅠㅠ
집에서 치료제나 백신을 만들수가 있나요?
실제로 사례가 있긴 합니다만, 사실상 불가능하다고 봐야죠 ㅠㅠ 돈도 많이 들고, 집에선 찝찝해서...
안녕하세요! 배지 갈아줄 때 DMEM 양은 몇 미리씩 넣으면 되나요??
90 mm dish는 10 mL, 75T flask는 15 mL이 적당합니다. 배지가 바닥 표면을 다 덮을만큼만 넣어주면 됩니다. 😄 혹시 권장량을 사용하고 싶으시면, 지금 사용하고 계신 제품이 corning사 제품인지, falcon사 제품인지, SPL 제품인지 등등 확인해보시고, 회사 홈페이지에 들어가시면 자료실에서 보실 수 있습니다!
@@ThisIsGraduateStudent 100 dish 입니다!
@@하재준-o4w 10~12 mL이 적당할듯 합니다!
Trypsin-EDTA를 처리하기 전에 DBPS를 처리하지 않으면 세포가 잘 안떨어지게 되나요??
네네 ㅠㅠ 세포를 키웠던 배지 안에 들어있는 각종 단백질들이 죄다 Trypsin EDTA와 결합해버리기 때문에, 효소가 제 기능을 못 하게 됩니다. 그래도 직접 해보니까 일부 잘리긴 해요!!ㅎㅎ
마침 이거 배우고 있는데 감사합니다
댓글도 감사합니다 🥰🙇🏻
@@ThisIsGraduateStudent 궁금한 것이 있는데 혹시 질문좀 할 수 있을까요??
1. 12:33 에 고정댓글로 0.05ml 라고 정정하셨는데 그럼 마이크로 피펫으로 세포가 들어있는 conical tube에 50ul를 뽑아서 cell dish에 넣으면 되는거죠??
2. 12:49 에는 세포가 들어있는 tube에 왜 2ml를 분주 하셨는지 알 수 있을까요?? 2x10^5개로 계산 해서 0.05ml는 그냥 예시로 말씀 해 주셨던 건가요??
그리고 cell dish에 미리 분주 해 놓은 배지양은 몇 ml이고 왜 그렇게 하셨는지도 알 수 있을까요??
13:00 10ml에 희석했으니 x10은 어떤 의미 인가요? 0.05ml넣어야 하는데 0.5ml를 넣는다 이런의미 인가요?
이렇게 해서 만약 총 10ml를 넣어야 한다면 0.5ml를 넣고 배지 9.5ml를 넣는건가요?
제가 지금 이 수업을 하고 있는데 세포수를 측정후 75ml cell flask에 배지와 더해서 넣는 양이 총 20ml 인데 왜 20ml인지 궁금해서요..
@@0208- 1. 네네, 맞습니다!
2. 0.05 ml은 예시고, 다음 날 세포를 급히 쓸일이 있을것 같아 영상에서 2 ml을 분주했던거 같습니다. ㅠㅠ
Cell dish에는 대부분 10 ml을 미리 분주해두는데, 본인이 사용하는 cell culture dish 제조사 홈페이지에 가면, 배지를 얼마나 넣어야 세포가 잘 자라는지 대략적으로 계산해둔 데이터 시트가 있습니다. 100파이 디쉬의 경우에는 대부분 10~15 ml을 넣는게 세포가 잘 자라는 편이라 그렇게 넣어주었습니다.
3. 15 ml conical tube의 세포 펠렛을 1 ml에 희석해도 되지만 그 경우에는 보통 마이크로피펫을 사용해야 희석이 가능해집니다. 코니칼 튜브에 마이크로피펫을 사용하게 되면 벽면에 피펫 몸통이 닿아 컨탐 확률이 높아지기 때문에, 보통 세포 연구하시는 분들은 10 ml에 희석하고 멸균된 serological pipet을 사용하지요. 0.05 ml을 넣어야 하는데 0.5 ml을 넣는다는 말씀 정확합니다.
총 10 ml을 넣어야할 때, 원래는 9.5+0.5가 맞는 방법입니다. 하지만 일의 편리성과 속도를 위해서 저는 그냥 10+0.5로 서브컬쳐를 합니다.
75ml cell flask가 혹시 25 T flask라고 적혀있는 건가요? Dish가 부착세포를 키우는데 사용된다면 flask는 일반적으로 부유세포를 키우는데 사용하는 편입니다. (flask도 부착세포 키울 수는 있습니다!) flask에 부유세포를 키울 때에는 배지를 좀 많이 넣어주는 편인데, 20 ml을 넣어주는 이유는 아마 넉넉한 영양분을 오래 공급해주기 위해 그런 것 같습니다.
저희 연구실에서는 한 번에 20 ml을 공급해서 7일간 키우기 보다는 10 ml을 넣고 3일마다 갈아주는 방식을 채택하고 있습니다. 이 방법이 노폐물을 갈아주는데 더 효과적이긴 합니다. 😄
혹시 더 궁금한 사항이 있으시면 언제든지 질문해주셔도 좋습니다. 🥰
@@ThisIsGraduateStudent
답변 감사합니다. 궁금증이 해결됐습니다!!
처음 볼때랑 실험 해보고 볼때랑 보이는게 다르네요.
@@0208- 처음 볼 때도 이해가 퐉퐉 될 때처럼 영상을 잘 만들고 싶네요 ㅋㅋㅋ큐ㅠㅠㅠ
이 실험을 통해서 일상생활에 적용시킬 수 있는 예 몇가지 들어주실 수 있나요??
세포 실험은 일상 생활에 적용은 힘들어요! 🥺 하지만 배지가 액체인게 보이시죠? 우리 몸은 수분이 충분해야 세포가 제 역할을 하면서 잘 죽지 않고 회복력이 유지된 답니다.
요즘 같이 손소독제, 마스크 등으로 건조하실텐데 핸드크림, 가습기로 수분을 잘 보충하고 유지하시는건 어떨까요? 정도가 적당하겠네요 😄
몇 가지 더 붙인다면 알콜은 75~80%에서 소독력을 가진다는것, 음식물 뚜껑을 열고 앞에서 얘기하지 않는것, 소독된 환경에서 작업을 원한다면 장갑과 소독약을 구비할 것! ㅎㅎ 🙆🏻♂️🙇🏻😊
배지 suction 할 때 세포들도 같이 안빨려나가나요??
네! 세포는 배지 바닥, 그리고 세포끼리 단백질로 단단히 연결되어있기 때문에, 석션으로 빨려나가지 않습니다. 물론 세포 위에서 대놓고 석션하면 빨려나가기 때문에, 영상에서처럼 구석에서 석션합니다.
또 centrifuge 이후에도 펠렛 형태로 서로 단단히 압축되어있기 때문에, 직접적으로 빨아들이지 않는이상, 석션되지는 않습니다. :)
학부연구생 중인데 감사합니다
도움이 되셨다니 다행입니다. 감사합니다. 🙇🏻🥰
안녕하세요. 이번에 Cell culture를 배우게 되어서 추가 학습으로 해당 동영상을 보았습니다. 덕분에 과정마다 상세하게 배울 수 있었습니다. 정말 감사합니다.
영상을 보던 중 궁금한 것이 하나 생겨서 여쭤보려 합니다. Cell counting 후에 다시 원하는 만큼 배지에 분주할 때, 1구역 당 cell이 200개 기준으로 2 x 10^6/ml가 되고, trypan blue가 2x로 들어가있기 때문에 2를 곱하여 4 x 10^6 / ml가 되는 것까지는 이해가 갔습니다.
근데 10 ml에 희석하여 x 10을 해서 넣는다는 부분에서 이해가 잘 안됩니다..ㅜㅜ 애초에 2 x 10^6/ml로 계산된 cell 수가 10 ml로 희석한 cell로 counting된 수이기 때문에 굳이 x10을 해주지 않아도 괜찮은 게 아닌가요?
밑에 동일한 질문을 댓글로 달아주셔서 친절히 설명해주신 것 읽어보았지만, 그래도 이해가 잘 안 되네요..
음 제가 계산한 방식은 뒤에 단위가 /ml로 끝나죠? 그 단위처럼 저는 10ml중 1ml만 갯수를 센 셈이에요. 하지만 저는 10ml에 세포를 희석했기 때문에, x10을 해줘야 제가 가진 희석액에 세포가 얼마나 있는지 알 수 있는거죠.
만약에 제가 저 10ml을 다시 원심분리 돌려서 이번에는 1ml로 펠렛을 부유시킨다면, 아마 1구역당 세포가 2000개가 나오겠죠. 저희는 액체에 들어있는 세포 개수가 필요한 것이지 액체 양이 중요한건 아닙니다. 항상 세포 수에만 집중하세용 ㅎㅎ 🥰
더 궁금한 사항이 있으시면 또 댓글 남겨주세요 🙇🙇
@@ThisIsGraduateStudent 늦은 시간인데도 친절한 설명 정말 감사합니다..!!
그럼 용액에는 '4 x 10^7 cells/10 ml 즉, 4 x 10^7 cells이 들어있다'고 생각하면 될까요?
@@hjs2126 네네 맞아요 ㅎㅎ👍👍
헐ㅋ셀카운팅기계 들이세요 ㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎㅎ
ㅋㅋㅋㅋ저희 쓰고 있습니다!! ㅋㅋ 이 영상은 그냥 교육용 ㅎㅎ