Mitochondria isolation from mammalian cells

[@yoona1349]

이 방법을 사용했을 때 얻어진 mitochondria는 activity가 있는 온전한 mitochondria인가요? 아님 단백질 추출용인가요?

[@CDRTtube]

안녕하세요.
이 방법을 통해 분리된 mitochondria는 일반적으로 activity를 지닌 상태로 존재합니다.
물론 여기에는 연구자의 기술과 숙련도가 중요하게 작용할 것 같습니다.
만약 kit 등으로 mitochondria를 분리하실 경우 조금더 안정적으로 분리가 가능하십니다.
수행하시는 모든 연구에서 좋은 결과 얻으시기를 기원 드립니다. ^^

[@Joainternational704]

빨리 다른 영상도 제작해서 다양한 것들을 보여주세요!!

[@CDRTtube]

영상 시청해주셔서 감사합니다 ^^

[@swimminggoggle]

안녕하세요 ! nature protocol을 참조하여 실험하시는 것 같은데 혹시 mitochondria pellet을 정량하여 WB하고 싶다면, RIPA w/ SDS로 풀어서, BCA 정량할 수 있을 까요? mitochondria pellet을 분리하신 후에 어떻게 pellet을 풀고, 정량하신지 여쭤보고 싶습니다!! 영상 잘봤습니다 ㅎㅎ

[@CDRTtube]

안녕하세요~ 질문 감사드립니다.
영상에 있는 WB 결과는 일반적인 western blot 과정과 동일하게 mitochondria pellet을 RIPA buffer lysis하고 단백질 정량하여 진행되었습니다.
Lysis buffer의 종류에 따라 BCA 또는 Bradford assay 등을 일반 western blot과 동일하게 진행하시면 됩니다.
Pellet의 수율이 좋지 않을 경우 주사기 stroke 부분을 조절해 보시면 많은 단백질이 회수되실 것으로 생각합니다.
진행 하시는 모든 연구에서 최고의 성과가 나오시기를 기원 드립니다 ^^
항상 건강하세요

[@swimminggoggle]

@@CDRTtube 아 그렇군요! 혹시 RIPA에 풀린 mitochondria를 sonication이나 추가 Lysis가 필요할까요 ?? mitochondria OMM protein인 TOM20로 확인해보았을 때, 같은 양이 걸리지 않더라구요

[@CDRTtube]

@@swimminggoggle 만약 mitochondria membrane 단백질을 대상으로 하신다면 아무래도 추가 lysis가 권장되기는 합니다. 그럴 경우 sonication이 조금 유리 할 수 있습니다.
그렇지만 sonication을 실시할때 volume 증가 등에 의한 변수가 발생할 수 있어서, 저희는 추가 lysis는 하지 않고 실험을 진행합니다.
추가 lysis를 했을때와 그렇지 않았을때 비교해 본 결과 추가 단계를 넣을 만큼 월등한 차이가 나오지 않았고,
저희 방법을 그냥 사용했을때에도 미토콘드리아 막 단백질 연구에 큰 문제가 발생하지는 않았었습니다.
실험이라는게,,, 꼭 이렇게 해야 한다.. 라는 것이 아니라서,, 답답할 때가 많이 있습니다. ㅠㅜ 부디 좋은 결과 나오시기를 진심으로 기원하겠습니다...