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Hi Carolina, thank you for your message. There are many possible reasons for the absence of signals/bands (see below). For further trouble shooting, it would be great to contact me by e-mail (tech.service@serva.de). Looking forward to hear from you. BR, Judith • Inefficient Transfer o Check the transfer efficency by using pre-stained marker o Adjust transfer setting, e.g. duration if necessary o Use the appropriate transfer buffer, e.g. for even transfer of large and small proteins o Use the appropriate transfer membrane, do not forget to activate PVDF membranes with either methanol or ethanol • Antibodies may have lost reactivity o Check whether the antibodies are stored as recommended o If in doubt, use a new vial of each antibody • Non-fat milk may mask antigen o Test your Western Blot protocol by using another Blocking reagent, e.g. BSA, Casein or Protein-free like SERVA BlueBlock PF • Sodium azid contamination o In chemiluminescence detection the presence of NaN3 should be avoided! Check all solutions! • Contamination of stock solutions o Check the detection solutions for possible contaminations. o If in doubt, use new ones. • Incorrect Antibody o Check whether the primary antibody is the right one to detect your protein of interest and whether the secondary antibody recognizes the primary antibody • Low Antigen-Antibody Binding/Affinity o Make sure that the binding affinity of the antibody is sufficient for your assay. Further aspects: • Make sure that the substrate used for detection fits the enzyme label • Make sure that the detection system is suitable for your detection method

I had this issue before, you should run control like B-actin, it is possible that the lysis buffer.

Yes. Or try our FocusGels. They do not need any buffer soaked wicks

Hallo Hr. Hermann. Entropie. Da die Proteine nativ aufgegeben werden, sind sowohl Ampholyte als auch Proteine Zwittermoleküle. Zunächst bewegen sich die "Teilchen", die am leichtesten wandern. Da die Ampholyte viel kleiner und demnach mobiler in der Matrix sind (Reibung/sterische Hinderung), wandern diese als erstes zu ihrem IP. Dort haben sie dann eine Null-Nettoladung (gleich viele + und - Ladungen) und stehen dem System nicht mehr als mobile Teilchen zur Verfügung. Sie werden quasi von beiden Richtungen gleichermaßen angezogen. Wenn man genau hinschaut vibrieren sie um den IP. Danach wandern die nächstmöglichen "Teilchen" im System. Das sind die Proteine. Auch diese wandern zu Ihrem IP. Sind diese angekommen gibt es keine "Teilchen" mehr, die wandern könnten. Stoppt man die IEF jetzt nicht, kommt es zum sogenannten Kathodendrift. Die Kraft des elektrischen Feldes dann so stark, dass die Ampholyte nahe der Elektroden (nun wieder die kleinsten Teilchen im System) gezwungen werden, sich zur Elektrode zu bewegen und somit aus dem System verschwinden. Man hat dann z.B. kein pH Gradienten 3-10 mehr, sondern -rein theoretisch- 3.1-9.9. Dann kippt es wieder und die Proteine wandern zu der neuen IP-Position. Dann wieder die Ampholyte und danach die Protein, usw. Der Gradient spreizt sich langsam auf. Durch die Struktur der Ampholyte passiert dies stärker an der Kathode, daher Kathodendrift. Sie grübeln zurecht, warum bei IPGs dennoch Ampholyte zugegeben werden. Ampholyte besitzen auch eine Protein-Löslichkeitskomponente. Zwitterionen sind beliebt als Detergenz. Rein empirisch hat sich eine Mischung aus Detergenz und Ampholyt bewährt um schönere Trennungen im IPG-Streifen zu erreichen. Ich hoffe ich konnte helfen. VG Marc Seidler

@@serva1240 Hallo Herr Seidler, vielen Dank für Ihre ausführliche und sehr schnelle Antwort. Dies bestätigt meinen jahrelangen sehr guten Eindruck von SERVA. Was die Ampholyten bei IPG Frage angeht, so habe ich dies also verstanden. Zu meiner ersten Frage, muss ich nochmal nachhaken: Dass die Ampholyte bis zu ihrem eigenen IP laufen ist verständlich. Aber wie kommt der zeitlich stabile pH Gradient zustande, der die Ampholyte entsprechend beeinflusst, bzw. deren Position auf dem Gel bestimmt? Zunächstz dachte ich, dies käme durch Katholyt/Anolyt in den wicks, aber bei ihre dickeren precotes Gele benötigen keine getränkten wicks. Entschuldigen Sie bitte das Nachbohren. VG

@@emilhermann4861 Die Ampholyte selbst bilden den Gradient. Zunächst liegen diese wild gemischt im Gel vor. Nun schaltet man den Strom an und die Ampholyte wandern und bilden den Gradient aus. Um es rein theoretisch zu beschreiben, hier zwei Beispiele. Beispiel: Ein Teilchen hat eine Plus- und eine Minusladung. Die Plusladung wird von der Kathode angezogen und von der Anode abgestoßen. Die Minusladung wird von der Anode angezogen und von der Kathode abgestoßen. Es bleibt diesem Teilchen also nichts anderes übrig, als dorthin zu wandern, wo es den wenigsten "Stress" hat - in die Mitte zwischen den Elektroden. Beispiel: Bei zwei Plus- und einer Minusladung würde das Teilchen doppelt so stark von der Kathode angezogen als von der Anode - quasi 2/3 zu 1/3. Dementsprechend würde sich das Teilchen 1/3 Richtung Kathode und 2/3 Richtung Anode auf dem Gel wiederfinden. Das ist natürlich blanke Theorie. Wie Sie in dem Webinar sehen sind die Ampholyte mit Verzweigungen, freien Elektrodenpaaren und auch partiell geladenen Gruppen versehen. Diese verfeinern die Eigenschaft im elektrischen Feld in Bezug auf die PIs. Die Elektrodenflüssigkeiten haben nichts damit zu tun. Bei den doppelt so dicken FocusGelen reicht einfach die Ionendichte aus um nicht währen der Elektrophorese zu verarmen. Die PRECOTES sind zu dünn. Die Ionendichte reicht nicht aus und würde verarmen. Hier muss man mit zusätzlichen Ionen im Wick nachhelfen. Grüße.

@@serva1240 Vielen vielen Dank für die Zeit, die Sie sich genommen haben, meine Fragen zu beantworten. Ich habe das Video erst kürzlich gefunden und da kamen mir die Fragen in den Sinn. Viele Grüße

Thank you very much

I guess it's the tray where you put the membrane

madxientist, you are absolutely right. To be concise, it is a matter of contamination or misbehaviour. Sometimes the plastic of a tray can interact with the AB due to contamination. The membrane can stick to the plastic surface and the solution can not swap around freely or the blocking reagent can interact with the plastic and causing sediments that stick to the membrane.

You are welcome.

Das freut uns! Vielen Dank.

We try to share most of our knowledge as good as we can. Thank you for the feedback.

Dear Bharat, No, the SERVA BlueTower is designed for four simultaneous runs, mainly needed in 2D Electrophoresis or high throughput applications. If one needs four individual drawers, there is the possibility to stack HPE BlueHorizon and have one power supply for each drawer. Like shown in this video: ruclips.net/video/PeCq7qGoKxg/видео.html